科研 | AGING-US：当归芍药散对 APP/PS1小鼠海马IncRNA与mRNA表达谱的影响及其转录组学的分析（国人佳作）
编译：洛雪，编辑：景行、江舜尧。
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随着人口老龄化，患有阿尔茨海默病的人数逐渐增多，给家庭和社会带来了沉重的负担，并且目前没有根治药物。有研究表明，当归芍药散（DSS）可以改善阿尔兹海默病人的临床症状，如记忆和认知功能障碍，但具体的作用机制尚未明确。本文选择了经典的AD模型小鼠——APP/PS1转基因小鼠，并通过转录组测序比较了对照组和DSS给药组的APP/PS1小鼠海马区域LncRNA和mRNA的表达情况，并对差异基因进行荧光定量PCR验证，构建LncRNA-mRNA共表达网络并分析其参与的GO及KEGG通路。综上，本研究利用转录组学的方法探讨了DSS治疗 AD 的作用机制，为进一步深入研究奠定了基础。
论文ID
原名：In-depth transcriptomic analyses of LncRNA and mRNA expression in the hippocampus of APP/PS1 mice by Danggui-Shaoyao-San
译名：当归芍药散对 APP/PS1小鼠海马IncRNA与mRNA表达谱的影响及其转录组学的分析
期刊：Aging-US
IF：4.831
发表时间：2020年11月
通讯作者：宋振远
通讯作者单位：湖南中医药大学
DOI号：10.18632/aging.104068
实验设计
结果
图1.当归芍药散的LC-MS / MS色谱图和质谱图。A-E：阿魏酸的保留时间、色谱图和质谱图（A.芍药甙,B .川芎内酯,C.苍术内酯I,D.阿利索B23-乙酸酯,E,在DSS）
2 DSS对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响
本文选择了经典的AD模型小鼠——APP/PS1转基因小鼠来探究DSS给药的效果，首先使用基因特异性引物PS1（608 bp）对转基因小鼠的基因型进行鉴定，如图2A所示，下一步通过水迷宫实验检测DSS对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响。水迷宫试验常用于评估小鼠的空间学习和记忆能力。潜伏期越短，说明动物的学习记忆能力越强。如图2B -2D所示，7月龄的正常C57BL / 6J小鼠可以迅速找到隐藏平台，潜伏期短，而APP/PS1小鼠找到的潜伏期明显延长，说明APP/PS1小鼠具有明显的学习记忆障碍。而DSS给药后，可以显著缩短潜伏期，说明DSS给药可以改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力。但在可见平台的水迷宫实验中，DSS给药组和对照组表现为无显著差异。
为了进一步确证DSS给药对APP / PS1转基因小鼠中认知功能的改善效果，作者采用免疫组织化学方法检测了小鼠海马区的Aβ沉积情况。如图2E，DSS给药组小鼠海马中的Aβ沉积明显低于APP / PS1小鼠（P<0.05）。突触是神经元传递信息的主要部分，突触标记主要包括神经元突触后致密物蛋白95（PSD-95）和突触素I（synapsinⅠ）。蛋白质印迹结果显示（图2F），DSS给药组小鼠的海马中PSD95和突触蛋白1的表达明显高于APP / PS1小鼠（P<0.05）。这些结果表明，7个月大的APP / PS1转基因小鼠自发性发展AD，而DSS改善了APP / PS1小鼠的学习和记忆缺陷。
WesternBlot检测表明（图2F），DSS给药组小鼠的海马内PSD-95和突触素I水平显著高于对照组小鼠（P<0.05）。这些结果表明，7月龄的APP / PS1转基因小鼠具有明显的阿尔兹海默病病理学特征，如脑内Aβ沉积增多、学习记忆能力受损等，而DSS给药可以改善APP / PS1小鼠的学习记忆障碍。
图2.DSS给药提高APP / PS1转基因小鼠的学习和记忆能力。（A）APP/PS1双转基因小鼠的基因型鉴定；（B-C）水迷宫实验，各组小鼠的潜伏期和穿越平台次数；（D）水迷宫测试的可见平台阶段的潜伏期。（E）APP/PS1小鼠脑中Aβ的免疫组织化学染色。（F）突触标记物的表达，PSD-95和突触素I。
3 DSS给药组和对照组小鼠海马的IncRNA与mRNA表达谱的差异分析
通过转录组测序检测两组小鼠的比较对照组和DSS给药组的APP/PS1小鼠海马区域LncRNA和mRNA的表达情况。转录组测序发现两组小鼠海马区域有285个LncRNA存在差异表达，其中有109个LncRNA上调，176个LncRNA下调，以错误发现率（FDR0.05）作为筛选标准校正，有110个LncRNA存在差异表达，其中有47个LncRNA上调，63个LncRNA下调。此外，有137个mRNA存在差异表达，其中有59个LncRNA上调，78个LncRNA下调（图3D），通过热图展示差异表达的LncRNA和mRNA（图3A，3B）。PCA分析表明，DSS给药组和对照组小鼠的基因表达谱之间存在显著差异（图3C）。但仍存在组内差异，故我们应该关注表达水平相对较高的基因。下一步，研究者选取了8个差异表达的LncRNA和mRNA作为验证转录组测序数据可靠性的候选基因，qPCR验证结果显示这些基因在给药组中高表达，与转录组测序结果一致。
图3. DSS给药组和对照组小鼠海马的IncRNA与mRNA表达谱的差异分析。（A）热图分析差异表达mRNA和（B）LncRNA；（C）主成分分析（PCA）（ D）差异表达的LncRNA和mRNA；（E）qPCR验证高表达的mRNA和LncRNA
4 LncRNA-mRNA共表达网络和功能分析
关于LncRNA及相关mRNA在DSS治疗阿尔兹海默病中的作用尚未见深入分析。在本研究中，研究者通过生物信息学方法分析研究了lncRNA-mRNA共表达网络的功能，为后续实验研究提供基础。作者研究了82个差异表达的mRNA和242个差异表达的LncRNA之间的1528个共表达关系（图4）。此外，作者还分析了与阿尔兹海默病相关的差异表达mRNA（表1）及其与LncRNA的共表达关系。共表达网络如图5所示，在网络图中，圆形节点代表mRNA，三角形节点代表LncRNA，节点的大小代表网络中节点的程度，两个节点之间的连线代表基因间的相互作用。LncRNA:chr5:9308050393084589, LncRNA A930030B08Rik, and LncRNA Firre显示出最广泛的相关性，表明它们参与了多种基因表达的调节，可能发挥重要的调控作用。而mRNA Pou3f4和mRNA Mgat3的失调表达与多个LncRNA相关。
表1. 患有阿尔茨海默氏病的小鼠（APP/PS1）海马中差异表达的mRNA
图4. LncRNA-mRNA共表达网络图。对差异表达lncRNA-mRNA的表达量进行皮尔森相关分析，选取皮尔森相关系数≥0.95的lncRNA-mRNA 对，从而 绘 制lncRNA-mRNA 共表达网络图。
图5.与阿尔茨海默氏病相关的差异表达lncRNA和mRNA的共表达网络。
GO（gene ontology）是按照生物过程(Biological process)、细胞组成(Cellular component)和分子功能(Molecular function)对基因进行注释和分类的，作者选择了共表达的基因进行功能富集分析，以进一步探索受lncRNA和mRNA共表达关系影响的生物学功能（图6）。GO富集分析结果表明，共表达的基因主要参与离子转运，蛋白泛素化，细胞内信号转导，神经元迁移，学习与记忆，长时程突触增强和谷氨酸能突触传递的调控（图6A）。
KEGG富集分析结果表明，共表达基因参与的通路主要富集于 Wnt和Ras信号通路、甘油磷脂代谢、磷脂酰肌醇信号系统、长期抑郁、谷氨酸能突触、多巴胺能突触、胆碱能突触等(图6B)。
图6. Go 分析(A)和 KEGG 通路富集分析(B)
讨论
中药在我国有着源远流长的历史，归芍药散（DSS）可以改善阿尔兹海默病人的临床症状，但具体的作用机制仍然未知。在本研究中，作者通过转录测序研究了对照组和DSS给药组的APP/PS1小鼠海马区域LncRNA和mRNA的表达情况，发现了285个差异表达的LncRNA，其中109个上调，176个下调，发现137个差异表达的mRNA，其中上调59个，下调78个。此外，作者随机选取部分转录组分析数据进行qPCR验证，证明了转录组测序结果的可靠性。
为了深入研究DSS对阿尔兹海默病的治疗作用，作者从差异表达基因中筛选了与阿尔兹海默病相关的基因。这些基因主要与神经元发育、突触传递、神经元迁移及学习或记忆等功能有关，这暗示着DSS治疗阿尔兹海默病的可能机制。例如，在神经生物学中，活性调节细胞骨架蛋白(ARC)在神经突触可塑性中发挥重要作用，ARC对基因表达具有负调控作用。转录组分析数据显示，DSS给药组小鼠的ARC mRNA水平明显低于对照组小鼠，说明DSS改善了ARC蛋白的表达，改善了神经突触可塑性功能障碍。作者的研究结果还表明，DSS可以影响小GTPase介导的信号转导(RhoA，Rab的mRNA水平)，降低MGAT3 mRNA水平，MGAT3是参与调控糖蛋白低聚糖生物合成的最重要的酶之一，且DSS给药组的APP/PS1小鼠海马中的Aβ沉积明显低于APP/PS1小鼠，暗示着DSS可能通过调节淀粉样前体蛋白代谢抑制Aβ生成。
LncRNA的作用范围十分广泛，机制非常复杂。为了研究差异LncRNA的功能，作者构建LncRNA-mRNA共表达网络并分析其参与的GO及KEGG通路。GO富集结果分析表明，离子转运、蛋白质泛素化、细胞内信号转导、神经元迁移、学习与记忆，长时程突触增强和谷氨酸能突触传递调控在DSS治疗阿尔兹海默病过程中起重要的作用。和前人的报道一致，有研究表明，DSS可通过调节单胺神经递质代谢改善衰老小鼠的记忆功能障碍；DSS可以改善与海马乙酰胆碱和多巴胺神经递质相关的记忆损伤。KEGG通路富集结果表明，Wnt和Ras信号通路、甘油磷脂代谢、磷脂酰肌醇信号系统、长期抑郁、谷氨酸能突触、多巴胺能突触、胆碱能突触等通路，暗示着LncRNA在DSS治疗阿尔兹海默病中可能发挥的作用。
结论
本文巧妙的利用了转录组学这一医学疾病研究的绝佳利器，研究发现了DSS给药后APP/PS1小鼠海马中异常表达的lncRNA和mRNA，构建lncRNA-mRNA共表达网络，并对其参与的生物过程及通路进行了详细分析，为进一步验证其药理作用机制提供了理论基础。
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