科研 丨Front. Microbiol.：分层腐殖质沼泽湖泊中固氮微生物基因组的组成及其季节动态
编译：阿昊，编辑：小菌菌、江舜尧。
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水生固氮行为通常会导致缺氮光照区（nitrogen-deprived photic zones）的蓝藻爆发。然而，基因组测序和环境调查表明，许多水生非蓝藻类群也有活跃的固氮作用。在这里，我们利用宏基因组数据和nif基因聚类分析揭示了沼泽中潜在固氮微生物的季节变化和基因组多样性。
研究结果证明，固氮微生物在功能上是不同的，主要包括绿细菌（Cholorobi）, 地杆菌（Geobacter），脱硫杆菌（Desulfobacterales）、甲基球菌（Methylococcales）和酸杆菌（Acidobacteria）。除了nifH（一种编码钼固氮酶的基因），我们还鉴定了与钒和铁固氮酶基因相对应的序列。在绿细菌（Chlorobi）群体中，nifH被包含在一个结构良好的逆转录转座子（retrotransposon）中。此外，聚光光合作用基因（light-harvestingphotosynthesis genes）的存在意味着在普遍的低光照条件下，无氧光合作用就可以促进固氮。在甲基球菌和脱硫杆菌中存在的rnf基因表明，在缺乏光合作用的情况下，其他的能量产生过程可能驱动能耗较高的固氮过程。因此，Trout Bog Lake底层的缺氧环境也为活性固氮微生物和初级生产者提供了合适的生态位。
研究者认为需要对这些潜在的固氮微生物活性进行进一步的研究，以阐明它们在淡水氮循环中的作用。
论文ID
原名：Diazotroph Genomes and Their Seasonal Dynamics in a Stratified Humic Bog Lake
译名：分层腐殖质沼泽湖泊中固氮微生物基因组的组成及其季节动态
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：4.118
发表时间：2020.7.1
通讯作者：Stefan Bertilsson
通讯作者单位：瑞典乌普萨拉大学
实验设计
我们纳入了Trout Bog Lake潜水层和深水层联合组装项目所囊括的42个潜水层和45个深水层样品的宏基因组数据。这些样本采集时间为春季至秋季（或夏末，视年份而定）。时间跨越2007年至2009年。在整个采样过程中监测温度和溶解氧，湖沼中的水温约为5°C，且处于亚缺氧状态（大多数样品的溶解氧浓度低于0.5 mg·L–1）。
结果
1.固氮细菌定性
我们从Trout Bog Lake下层滞水带水样中确定了8个主要的系统发育类群，分别为:（1）变形杆菌中的脱氮单胞菌（Sulfurimonas）；（2）地杆菌（Geobacter）；（3）脱硫杆菌（Desulfobacterales）；（4）甲基球菌（Methylococcales）；（5）酸杆菌（Acidobacteria）；（6）β-变形菌（Betaproteobacteria）；（7）疣微菌门（Verrucomicrobia）和（8）绿细菌（Cholorobi）。
2.nifH基因丰度的季节变化及其与环境因子的关系
由于2008年是唯一拥有环境数据的年份，因此研究者仅分析了2008年nifH丰度与环境条件之间的关系。2008年期间，表层和下层湖沼中的潜在固氮菌丰度相似（图1）。固氮酶基因丰度与溶解氧无关。然而，在溶解氧低于平均值的情况下，个别浅层样品中潜在固氮菌的相对丰度通常达到0.025%（相对总读数）以上（图1A）。
在上层水带和下层水带中的潜在固氮菌的季节变化情况与测量的其他环境参数（包括TN、TDN、TP和TDP）没有显著的线性相关（图1和表1）。有趣的是，TN:TP比率和固氮酶基因丰度遵循一个多项式函数，这可能反应了固氮菌对这个腐殖质湖泊中的TN:TP比率的响应（图1B）。
固氮酶编码基因丰度的季节性分布在表层和下层之间有所不同，这表明环境控制了水中的固氮微生物（图1A）。特别是对于深水层，固氮菌在5月（早春至早春）并不丰富（图1A）。结合这些nifH相对丰度的整体动态，我们观察到了由IMG工具鉴定的nifH基因的分类关联的主要变化（图2）。经过春季混合后，变形菌门的分支成为nifH编码亚群的主要成员。相比之下，绿细菌的生长似乎受到稳定的分层和缺氧条件的支持，这种情况在6月至10月在Trout Bog Lake盛行。
表1.2008年的环境数据
图1.2008年采样期间表层和下层藻类固氮酶基因丰度与环境数据的比较。（A）用IMG注释计算固氮酶基因百分率。（B）利用IMG注释研究了TN:TP比值固氮酶基因丰度的关系。
图2.不同分类群对Trout Bog Lake固氮营养群落的相对贡献。
3.淡水和海洋中的非蓝藻固氮菌
非蓝藻固氮酶基因确实已经描述了海洋表面和深水域的固氮菌。在太平洋的广泛调查中，北太平洋的固氮酶基因库主要由蓝藻细菌nifH系统类型组成，而在南太平洋和西北太平洋的深度梯度上，α变形菌门和β变形菌门非常丰富。
固氮微生物在春季较少，其原因在于融雪所造成的大量陆地有机物和营养物的流入，这有利于缺乏nif操纵子的异养生物生长。此外，nif基因的流行似乎与光合细菌有关，因为与绿细菌相关的nifH系统型在许多样品中都很丰富（图2）。根据研究者目前掌握的知识，只有少数研究致力于绿细菌原位固氮营养潜力，我们的研究结果表明，绿细菌可能在腐殖质湖泊群落中发挥广泛而重要的固氮作用。
4.固氮酶操纵子结构和附属的N固定蛋白
研究者在Trout Bog Lake中发现了nifHDK的操纵子存在，但这一现象并不普遍。在与甲基球菌目（Methylococcales）相关的基因组中（图3），nifE、nifN和nifB位于辅助固氮基因nifQ、nifZ、nifU、nifS和nifW的下游。这些基因与nifHDK的基因簇不同（图3B）。除了变形菌外，辅助基因nifQ、nifZ和nifW也出现在β变形菌的固氮基因组中（图4）。另一种固氮酶中仅含铁元素，存在于附属于绿细菌的基因组中，研究者认为这种固氮酶可能在N固定和产甲烷中具有潜在的双重作用。
图3.两个MAGs固氮酶基因簇与甲基球菌的潜在N-固氮酶基因簇的比对。
图4.五个MAGs的固氮酶基因簇的排列，这些MAGs被分类为n. δ 变形菌纲和β变形菌纲。
5.与固氮酶表达和活性有关的遗传因素
nifHDK基因侧翼存在逆转座因子（retro-transposable elements）是一个令人惊讶的发现，这可能表明广泛的基因转移。例如，绿细菌中的固氮酶（图5）具有许多逆转座因子的特征。我们发现了与逆转录酶（RT）和一个内肽酶相对应的编码区以及几个直接和反向重复序列。
反转录酶也存在于Trout Bog Lake中，但在这些变形菌中不可能确定一整套额外的和不可缺少的转座因子基因。编码翻译后修饰蛋白的基因，如PII家族和DraG/DraT基因，也被发现在nifH附近，或者仅仅在nifHDK簇的几百个碱基对之外。
图5.四个MAGs固氮酶基因簇与绿细菌的比对。
6. N固定与能量代谢的中心通路
我们对整个基因组进行了分析，固氮是一个需要大量能量的过程，固氮行为受到能量供给的影响。Trout Bog Lake和其他腐殖质湖泊具有较低的阳光辐照度和亚缺氧到缺氧的特点。通过对假定固氮微生物的基因组研究，我们发现了几种产生或保存ATP的方法。绿细菌、酸杆菌和变形菌是nifH基因最丰富的门。因此，我们将代谢分析重点放在这三个类群的功能注释上，最终发现：绿细菌产生能量的机制可能是光合作用、碳固定和硫化物氧化；Trout Bog Lake中编码nifH的酸杆菌似乎是通过碳水化合物降解获得能量的，但其主要的能量来源尚不能确定；在nifH编码的变形菌MAGs（metagenome assembled genomes）中发现了指示甲基营养的基因（pmoA、mdh1、mxaF），表明C1化合物可能是碳源和能量源。表2中报告了本分析中所含MAG的估计完整性。
表2. JGI-IMG数据库中关于MAGs的信息用于基因组分析。
7.淡水湖底层水微生物固氮生态学研究
在Trout Bog Lake中，上覆的表层湖水与大气接触，并受到有氧光合作用的深度影响，而底层湖水的溶解氧通常少得多，在夏季会季节性缺氧。从这个意义上讲，Trout Bog Lake的底层湖水具有代表性，可以作为温带和北部地区数量可观的小型湖泊的模型。
氧的耗竭是一个决定性的步骤，因为氧是氮固定的一个众所周知的破坏因素；它可以抑制固氮酶的活性，也可以抑制nifH基因的转录。对于化学营养细菌来说，其可以在缺氧水体中从还原性有机物中获得能量。在脱硫菌中发现了一条完整的硫酸盐还原途径。与使用氧气和其他更有利的电子受体相比，使用硫酸盐作为微生物的电子受体与能量产量降低有关。在淡水中，已经证明硫酸盐还原菌也可以通过使用有机化合物作为还原剂和氧化剂进行生长繁殖。淡水硫酸盐还原菌也可以与产甲烷菌共生，氧化乳酸和乙醇，而产生的氢气可通过产甲烷菌有效去除。在这里分析的脱硫杆菌MAGs中，存在一整套参与丙酮酸转化为醋酸盐的基因。根据微生物的生理需求，WL（Wood-Ljungdahl）途径有助于固碳或节能。在WL途径反向作用的情况下，有机化合物氧化产生的还原力至少在理论上可以作为固氮能源。
结论
我们在底层湖水中发现了丰富多样的非蓝藻微生物群落，这些微生物似乎有潜力进行固氮。在春季，潜在的固氮微生物不那么丰富，可能是因为大量陆地有机物和营养物通过融雪涌入，这可能有利于缺乏nif操纵子的异养生物生长。此外，nif基因的流行似乎与光合细菌有关，因为在许多样本中都存在与绿细菌相关的nifH。据我们所知，只有少数研究证明了绿细菌的原位固氮潜力，我们的结果强调，绿细菌在固氮腐殖质湖泊群落中也可能发挥广泛而重要的作用。
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