CAR-T疗法迎来收获期，如何突破安全性瓶颈？
近日，药智数据显示，药明巨诺瑞基奥仑赛注射液（relma-cel）的上市申请进入“待审批”状态，有望获批成为国内第二款CAR-T产品。此前，复星凯特CAR-T细胞治疗产品阿基仑赛注射液（又称：益基利仑赛注射液，代号：FKC876）已率先于2021 年 6 月获批上市。
CAR-T细胞疗法作为一种全新的癌症治疗手段，备受市场关注。自2017年以来，全球已有多款CAR-T细胞疗法获批上市。然而随着CAR-T疗法进一步应用，安全性问题日益凸显。
CAR-T技术迭代发展，但仍存在安全性问题
早在40年前，科学家就了解到T细胞在抗癌中发挥着重要作用，这种细胞能够识别并清除肿瘤细胞，但单靠患者体内的少量T细胞无法成功围剿数量众多的肿瘤细胞。随后，基础科学不断更新，围绕T细胞的肿瘤免疫治疗也一步步成为现实。目前，CAR技术已经过多代发展（图1）。
图1. 传统 CD8+ T细胞和CD8+ CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞和CAR结构演变方面的差异示意图。
然而，已批准的CAR-T疗法毒副作用也逐渐显现。当经过基因工程改造的CAR-T细胞重新输回患者体内时，除了发挥抗肿瘤作用，还可能会导致细胞因子释放综合征（CRS），严重威胁患者的生命。
为了提高CAR-T疗法的安全性，目前一个解决方案是为CAR-T细胞设计一个快速且可逆的“关闭”或“开启”安全开关。经过优化的CAR-T细胞可能具有更好的疗效以及更少的副作用。近日，南方医科大学 Kui Cheng等发表在Journal of Medicinal Chemistry的文章总结了当前主要研究的一些基于小分子的CAR-T细胞新型安全开关。
小分子安全开关：降低CAR-T细胞疗法相关的毒性
某些小分子化合物有望赋予CAR-T细胞功能灵活性，使其在“开”和“关”状态之间切换。此外，它们还可以使用药物定向转运技术选择性地递送至靶组织，这将有助于进一步缓解毒性问题。
目前报道的用于CAR-T开关设计的小分子化合物主要有FITC、叶酸、rimiducid、雷帕霉素、蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 化合物和达沙替尼等。（图2）。
图2. 小分子化合物应用于安全开关的不同机制的示意图。
基于FITC/叶酸的安全开关介导的拟免疫突触的组装
这是一种双功能/双特异性安全开关，包含两个关键模块：一个具有与TAA特异性识别和结合的能力，另一个具有与CAR重新编程的抗原识别域结合的能力。这种安全开关以时间或剂量依赖性方式充当CAR-T细胞和肿瘤细胞之间的拟免疫突触，将CAR-T细胞转变为“开启”状态。只有在给予小分子安全开关后，才能形成拟免疫突触，触发CAR-T细胞消灭靶癌细胞。FITC和叶酸常用于设计此类安全开关（图3）。
图 3. 基于FITC/叶酸的安全开关示意图
FITC是最广泛使用的荧光染料，具有荧光量子产率高、易受微环境变化影响而不会对偶联抗体的特异性产生显着影响的优点。而且，抗FITC抗体的基因序列已被广泛研究，促进了FITC在CAR-T细胞安全开关设计中的使用。叶酸是一种水溶性B族维生素，正常组织和肿瘤组织中FRα的差异分布以及叶酸的高亲和力和稳定性使FRα和叶酸成为设计的潜在目标安全开关。
利用雷帕霉素诱导FKBP12和FRB结合域的组装来控制CAR-T细胞的激活
CAR-T细胞具有细胞外抗原识别域和细胞内信号域。设计基于小分子开关的另一种策略是在小分子药物存在的情况下拆分这两种结构并重新连接它们。
雷帕霉素和雷帕霉素类似物（rapalogues）可用作二聚化化学诱导剂（CID）来组装引入CAR结构的结构域。雷帕霉素同时占据两种蛋白质的两个不同的疏水结合口袋：人FK506结合蛋白(FKBP12)和FKBP-雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的FKBP12-雷帕霉素结合（FRB）域。因此，将FKBP12-雷帕霉素-FRAP/FRB三元复合物插入到CAR结构中可以构成一个基于小分子的安全开关来控制CAR-T细胞活动。
在雷帕霉素存在下，嵌合抗原受体执行抗原识别和信号传导功能。在雷帕霉素不存在的情况下，抗原识别域与CAR结构的信号转导域分离，使CAR-T细胞处于“关闭”状态（图4）。因此，雷帕霉素可用于远程调节CAR-T细胞的活动，以避免潜在的致命毒性作用。
图4. 雷帕霉素作为分子开关的示意图
Rimiducid诱导Caspase-9二聚化并促进过度活化的CAR-T细胞凋亡
当CAR 结构包含编码自杀基因的融合蛋白时，Rimiducid（AP1903）和更昔洛韦等CID可以诱导 CAR-T细胞凋亡。使用Rimiducid和诱导型caspase-9组成安全开关，可以通过小分子诱导的细胞凋亡迅速终止CAR-T细胞的治疗活性（图5）。
图5. iCas9系统诱导CAR-T细胞凋亡示意图。
PROTAC技术控制CAR的裂解和降解
当CAR识别并结合靶肿瘤细胞表面相关肿瘤抗原，CAR-T细胞即保持激活状态。因此，可设计一种安全开关，通过精确控制CAR的降解来远程和可逆地调节CAR的表面呈现，以调节CAR-T细胞抗癌活性，并降低潜在毒性。
目前，PROTAC是降解细胞内特定蛋白质的最有效方法。CAR是一种人工合成的蛋白质，通过将蛋白降解子（degrons）掺入CAR，一旦蛋白降解子被蛋白水解酶识别，理论上降解整个CAR蛋白应该是可行的。目前，多种新型小分子已被用于控制CAR 的降解（图6)。
图 6. PROTAC技术通过泛素-蛋白酶体系统控制CAR降解的示意图
达沙替尼直接阻止CAR-T细胞激活
现有药物也可作为药理安全开关，暂时灭活CAR-T细胞以控制其毒性。并且，停用安全开关药物后，抗肿瘤作用可恢复。
达沙替尼是一种针对BCR-ABL和SRC的小分子多酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）来抑制TCR介导的信号转导、细胞增殖、细胞因子产生和体内T细胞反应。因此，达沙替尼可作为一种潜在的药理学安全开关药物。但达沙替尼并非专门设计为小分子安全开关，将其称为CAR-T细胞的小分子安全开关还存在争议。
总结：小分子CAR-T开关任重道远
目前对CAR-T细胞疗法的研究主要集中提高临床疗效、减轻抗原逃逸和增强CAR-T细胞的特异性等方面。为了实现这些目标，在嵌合抗原受体构建体中引入了各种修饰。目前，处于开发阶段的第四代CAR，可以传递细胞因子或趋化因子，以产生对免疫抑制性肿瘤微环境的抵抗力。此外，正在开发的双靶点和多靶点CAR可同时结合两种或多种肿瘤抗原，以提高对肿瘤细胞的特异性。
尽管CAR-T细胞疗法具有出色的临床表现，但当肿瘤负荷不可预测且T细胞的活性不受控制时，仍难以在不引起严重毒副作用的条件下达到最佳治疗水平。所以提高CAR-T 细胞疗法的安全性仍是该疗法未来改进的重要方向。
目前已有多种小分子化合物被报道可用于CAR-T开关设计，但尚处于早期研究阶段，能否真正提高CAR-T疗法安全性还有待观察。
参考文献
Zheng, Y., Nandakumar, K.S. and Cheng, K. Optimization of CAR-T Cell-Based Therapies Using Small-Molecule-Based Safety Switches. Journal of Medicinal Chemistry. 2021
https://doi-org.ezproxy.lb.polyu.edu.hk/10.1021/acs.jmedchem.0c02054