DNA甲基化结合肿瘤微环境发7分 SCI / 四六文摘

题目：DNA methylation regulator-mediated modification patterns and tumor microenvironment characterization in gastric cancer

DNA甲基化调控因子介导胃癌修饰模式和肿瘤微环境特征

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摘要

DNA甲基化与肿瘤免疫和免疫治疗之间具有相关性。然而，DNA甲基化对肿瘤微环境特征和免疫治疗效果的作用仍然需要进一步阐明。本研究对20个DNA甲基化调控因子的基因表达水平进行聚类，评估1619例胃癌患者的DNA甲基化调控因子模式和肿瘤微环境特征。共发现三种胃癌亚型具有不同的DNA甲基化修饰模式和肿瘤微环境特征。随后，构建DNA甲基化相关性打分（DMS）评估DNA甲基化修饰。高DMS与免疫激活状态，肿瘤突变负荷较高和预后较好有关。低DMS与间质激活，免疫细胞浸润缺失和生存较差有关。总的来说，DNA甲基化修饰模式有助于对胃癌肿瘤免疫微环境的认识，指导未来个性化的免疫治疗策略。

流程图

结果

1. 数据的获取和整理

从GEO和TCGA数据库下载8个GC队列，包括1619例患者的转录组数据。从UCSC下载体细胞突变数据和甲基化数据。

2. GC患者中DNA甲基化调控因子的多组学研究

本研究收集了20个DNA甲基化调控因子，包括3个writers，3个erasers和14个reads（图1A）。这些调控因子的突变率较低（图1B），MECP2，DNMT3B和ZBTB38的拷贝数扩增频率较高，而MBD1和MBD2主要发生拷贝数缺失（图1C）。使用STRING构建蛋白质-蛋白质互作网络（图1D）。大多数调控因子在肿瘤组织中表达水平较高（图1E）。以上结果表明，DNA甲基化调控因子的互作可能在胃癌发生，发展和异质性中起到关键作用。

图1 胃癌患者的DNA甲基化调控因子多组学分析

3. DNA甲基化调控因子的预后和免疫特征

作者对8个队列的1619例患者进行分析，发现所有调控因子与细胞周期通路正相关。表达水平分析发现DNMT1，UHRF1和UNG呈正相关（图2A）。通过单因素Cox回归分析研究这20个DNA甲基化调控因子的预后价值。这些调控因子的相互作用和预后作用如图2A所示。MBD2，TET2和DNMT1的表达水平与免疫细胞呈正相关（图2B）。MBD2高表达组中免疫细胞浸润程度较高。GSEA分析表明，T细胞受体信号通路，B细胞受体信号通路，抗原处理呈递通路和免疫或炎症相关通路在MBD2高表达组中显著富集（图2C）。MBD2在MSI队列，ACRG队列（图2D）和TCGA STAD队列（图2E）中均高表达。生存分析表明，在PRJEB23709队列（图2F）和UC_Atezo队列（图2G）中MBD2高表达的患者预后较好。此外，MBD2高表达患者的临床反应较高（图2H）。这些结果表明，DNA甲基化调控因子与肿瘤微环境密切相关，MBD2与免疫细胞浸润正相关，可以作为胃癌预后和免疫治疗效果的生物标志物。

图2 DNA甲基化调控因子的预后和免疫特征

4. GC患者的DNA甲基化修饰模式

作者对GC队列的DNA甲基化调控因子的表达水平进行无监督聚类。患者分为三个亚类，分别为模式A（510例），模式B（749例）和模式C（360例）。ZBTB4, ZBTB38, MBD1, UHRF2 和TET2在模式A中高表达，UHRF1, DNMT1, UNG 和NTHL1在模式B中高表达，ZBTB33, TET3, TET1, TDG, DNMT3A, DNMT3B和MBD3在模式C中高表达（图3A）。根据3D-PCA区分这三个模式，结果表明这三组明显分离（图3B）。生存分析表明，模式B与预后较好有关（图3C），且CD8 T细胞，CD4 T细胞和树突状细胞活性最高（图3D）。通路分析表明，模式B富集于免疫或炎症相关通路，模式A富集于上皮-间质转化等通路（图3E）。

图3 GC队列的DNA甲基化修饰模式

5. 三种DNA甲基化调控模式在ACRG队列中的临床和转录组特征

根据DNA甲基化调控因子的表达水平对ACRG队列分为三种DNA甲基化模式（图4A）。根据PCA可以将三个模式的患者区分。模式A和模式B的没有生存优势（图4B）。模式B免疫激活特征较为丰富，模式A基质激活较为丰富（图4C）。模式B中免疫细胞浸润和免疫特征上调（图4D）。此外，根据ACRG队列的分子亚型，作者发现MSI亚型的大部分患者属于模式B，EMT亚型大部分患者为模式A（图4E）。

图4 ACRG队列的三种DNA甲基化调控模式的临床和转录特征差异

6. DNA甲基化相关基因簇的临床和转录特征和DMS构建

为进一步研究不同DNA甲基化调控模式的异质性，作者鉴定组间差异表达基因，共鉴定到859个DNA甲基化调控模式相关基因。GO分析表明基因富集在免疫和DNA甲基化相关事件（图4F）。这些结果表明，DNA甲基化调控模式的不同临床和转录特征可能是这些差异基因造成的。单因素Cox回归分析表明265个基因具有预后价值。对这些基因进行无监督聚类分析，将GC患者分为三类（图5A），生存分析表明簇A的预后较好（图5B）。簇A患者的CD8 T效应因子和APC共刺激更高（图5C）。簇C患者的血管生成和EMT1-3特征打分更高。这些结果表明，GC中存在三种不同的免疫表型。作者构建基于265个DNA甲基化相关特征基因的风险打分模型（DMS）评估DNA甲基化状态。模式B的DMS中位数最高，模式A的DMS中位数最低（图5D）。对DNA甲基化基因簇来说，簇A的DMS中位数最高，簇C的DMS中位数最低（图5E）。对四种ACRG亚型来说，MSI亚型的DMS最高，EMT亚型的DMS最低（图5F）。根据DMS打分，将患者分为DMS高组和DMS低组，DNA甲基化调控模式，ACRG分子亚型，基因簇和DMS的相关性见图5G。

图5 DNA甲基化基因簇的临床和转录特征和DMS构建

7. TCGA队列的DMS预后价值和GC亚型分析

接下来，作者研究DMS对胃癌患者预后的影响。生存分析表明，ACRG队列DMS高组的生存期较长（图6A），并使用TCGA STAD队列进行验证（图6B）。多因素Cox回归模型表明DMS可作为预测患者生存期的独立预后因子。此外，作者使用多队列对DMS的预后价值进行验证。此外，也可以使用DMS评估GC患者的临床特征（图6C）。MSI和EBV-positive组的DMS打分更高（图6D）。以上结果表明，DMS是一个重要的预后标志物，可以有效预测OS，DFS，RFS和GC患者的临床特征，具有潜在的临床应用价值。

为进一步研究DNA甲基化调控因子模式，DMS和GC患者的甲基化状态，作者首先采用4个CIMP亚型。结果表明，具有CIMP状态的患者DMS更高（图6D）。此外，作者下载TCGA STAD 450K数据，基于非监督聚类将患者分为三组，作者命名为MethCluster。生存分析表明C2预后最好，DMS最高（图6E）。免疫细胞比例和免疫特征分析表明C2的活化的CD8 T细胞和CD4 T细胞丰度较高。此外，C2的MHC表达丰度更高。DNA甲基化调控因子模式，TCGA亚型，CIMP状态，MethCluster和DMS之间的关系如图6F所示。

图6 DMS预后价值和TCGA队列的GC亚型的验证

8. DMS对免疫治疗的预测价值

接下来，作者研究DMS是否可以预测患者的免疫治疗效果。对免疫治疗有反应的患者DMS较高（图7A-7B）。MSI-H和EBI-positive组的患者DMS更高（图7C）。在UC_Atezo队列中，接受免疫治疗的患者中高DMS组的患者总生存期较长（图7D）。部分缓解（PR）和完全患者（CR）组的DMS较高（图7E）。作者评估结合TMB和DMS预测预后的效果，结果表明高DMS和高TMB组的总生存期较长（图7F）。免疫炎症表型的患者DMS最高（图7G），高DMS组预后较好，临床治疗效果较号（图7H-7K）。为进一步评估DMS在GC中的预测性能，作者将DMS与之前发表的10个应答ICI基因表达免疫特征进行比较。结果表明，DMS预测免疫治疗反应的效果最好，AUC为0.873（图7L）。以上结果表明DMS可以有效预测免疫治疗的效果。