常用偶联剂的副产物：来源，毒理学评估和测定方法
由于酰胺和酯官能团在原料药中普遍存在，通常来说，偶联剂首先活化羧酸基团，然后是胺或醇的亲核攻击，形成相应的酰胺或酯。总体方案如图1所示，用偶联剂（CR）处理羧酸形成了活化的络合物，然后将其用亲核胺源处理以形成酰胺键和偶联剂副产物。
图1.使用偶联剂（CR）在最终产物和副产物中生成酰胺键的示意图。
对易得的偶联试剂进行筛选后，有效偶联试剂的选择通常基于官能团的选择性，收率以及最少的副反应。但是，在研发过程中，经常会忽略这些试剂的副产物，而且在结构上与原料药（DS）无关。这些副产物通常不受ICH-Q3A和B中所述的鉴定和鉴定阈值的限制，也没有像ICH-Q3C中所述的与残留溶剂相同的要求。这些副产物的限值可以根据可用的毒理学数据，日剂量，治疗持续时间和其他风险效益考虑因素进行单独考虑。对于大规模药物生产中使用的几种常用偶联剂，表1中所示，在几种情况下，可以形成偶联剂的副产物，经水处理后，已知的副产物列于表1。
表1.常用偶联剂的关键工艺参数，副产物和建议的TTC。
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Coupling Reagent |
CR-Byproduct |
In Silico Evaluation and Summary of Toxicological Data |
Proposed TTC µg/day |
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1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) |
Imidazole |
No structure alerts; Reproductive/developmental toxicity at high dose |
100 |
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Propylphosphonic anhydride (T3P) |
Propylphosphonic acid |
No structure alerts; No reported toxicological data. |
100 |
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Dipropyl-diphosphonic acid |
No structure alerts; No reported toxicological data. |
100 |
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Tripropyl-diphosphonic acid |
No structure alerts; Skin and eye irritant. |
10 |
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Onium Coupling Reagents (A) HBTU (Y = C, R = H, X= PF6) (B) HCTU (Y = C, R = Cl, X= PF6) (C) HATU (Y = H, R = Hl, X= PF6) |
1,1,3,3-tetramethylurea (TMU) |
Reproductive/developmental toxicity |
1 |
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1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-ol (HOBT) |
No structure alerts; Skin and eye irritant. |
10 |
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3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin-3-ol (HOAT) |
No structure alerts; Skin and eye irritant. |
10 |
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6-chloro-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-ol |
No structure alerts; Skin and eye irritant. |
10 |
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hexafluoro phosphate ion |
No structure alerts; No reported toxicological data. |
100 |
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Phosphonium coupling reagents (A) BOP (Y = C) (B) PyBOP (Y = N) |
Hexamethylphosphoramide (HMPA) 1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-ol (HOBT) 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin-3-ol (HOAT) |
Likely human carcinogen |
1 |
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(C) PyClOP (X = Cl) (D) PyBrOP (X = Br) |
tri(pyrrolidin-1-yl)phosphine oxide |
No structure alerts; No reported toxicological data. |
100 |
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(E) BOP-Cl bis(2-oxooxazolidin-3-yl)phosphinic chloride |
oxazolidin-2-one |
No structure alerts; No reported toxicological data. |
100 |
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Carbodiimide Coupling Reagents Dicyclohexylmethanediimine (DCC) guinea pig: LD50 = 10 mL/kg (skin) |
1,3-dicyclohexylurea (DCU) |
No structure alerts; No reported toxicological data. |
100 |
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Diisopropylmethanediimine (DIC) Rat: LC50 = 0.41-0.922 mL/L (6 h) Rat: LC50 = 20 ppm/4 h |
1,3-diisopropylurea |
No structure alerts; No reported toxicological data. |
100 |
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3-(((ethylimino)methylene)amino)-N,N-dimethylpropan-1-amine (EDC) |
1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylurea |
No structure alerts; No reported toxicological data. |
100 |
对表1中列出的每种副产物进行了毒理学数据库（例如，有害物质数据库（HSDB），化学物质毒性作用注册表（RTECS）的搜索。在大多数情况下，没有毒理学数据。随后，使用行业标准计算机模拟结构/活性关系模型SAR/（Q）SAR对这些物质进行评估，以预测潜在的诱变和/或致癌活性以及其他毒理学终点。结合两个评估的结果，并根据Dolan等人的方法分配了毒理学关注阈值TTC。简而言之，TTC原则是人类暴露的水平，据估计，终身暴露不会对人类健康构成可观的风险。Dolan等人通过分析受管制的致癌物和非致癌物的可用数据得出了TTC，从而为对三类化合物的毒性或几乎没有毒性数据的三类化合物的可接受限量提出了科学依据：（1）可能致癌的化合物，（2）可能有力或剧毒的化合物，以及（3）不太可能有力，剧毒或致癌的化合物。这些类别的材料的相应TTC分别为1、10和100 μg/天。这些类别涉及所有类型的毒理学终点，包括致癌性，免疫毒性，神经毒性和发育毒性。这些类别的阈值基于以下假设：即使随后的测试表明在这种情况下偶联剂，属于三类之一，低于TTC水平的暴露不会对人类健康构成可观的风险。CR副产品在表1是根据颜色分别表示为1、2或3类化合物的颜色，红色，黄色和绿色。
举例讨论
1. 碳二亚胺偶联剂
碳二亚胺是第一个合成的偶联剂，至今仍被广泛使用。偶联的第一步涉及羧酸与碳二亚胺的反应以形成O-酰脲。差向异构化和产率问题已导致开发新的偶联剂，例如羟基苯并三唑（HOBt）和其他偶联剂。碳二亚胺和所得的脲副产物设计为水溶性的（例如EDC/乙基-（N'，N'-二甲基氨基）丙基脲）或水不溶性的（例如DCC/二环己基脲），这会影响反应溶剂的选择和纯化方法的选择。
图2.碳二亚胺比色分析的反应方案
图3.具有单离子监测（SIM）信号的反相LC-MS对EDC（红色）及其尿素副产物（蓝色）的代表性色谱图
仪器：具有单四极杆MS的UPLC；色谱柱：C18；流动相：等度98%的200 mM甲酸铵（pH = 4）和2%的乙腈；柱温：10 °C；检测：SIM模式，EDC为156 amu，尿素副产物为174 amu。注意：将EDC和尿素信号标准化以相同的比例出现。
几种基于HOBt/取代的HOBt和鎓盐的偶联剂。这些试剂与羧酸反应形成活性酯，然后与胺反应。在胺与偶联剂反应形成胍副产物的情况下，经常会发生副反应，因此加料顺序、时间至关重要。反应通常快速，几乎没有差向异构。
在我们的实验室中，开发了测定API中残留的羟基-苯并三唑（HOBt），四甲基脲（TMU）和PF6盐的方法。HOBt是使用反相HPLC和UV检测法测定的。PF6盐使用带有CAD的反相HPLC（带电气溶胶检测）测定。TMU使用顶空进样的GC，FID检测测定。由于涉及的产品范围广且紫外线吸收差，因此该方法的开发具有挑战性。代表性色谱图显示在：图4中的HOBt，图5中的PF6盐测定和图6中的TMU。色谱条件总结于表2中。
图4. 反相HPLC-UV检测HOBt的代表性色谱图
色谱柱：C18，3 μm，100x 3.0 mm；流动相：20 mM甲酸铵（pH3.7），乙腈；梯度：3 min: B 10-30%；3 min:B 30-100%；1 min：B 100%；柱温：40 °C；流速：1.0 mL/min；紫外线检测器：310 nm；样品浓度：用50:50的MeCN/水溶液稀释，API浓度为3mg/mL；进样量：20 μL。
图5.带有CAD和UV检测的反相HPLC代表的PF6盐的色谱图（注意，UV检测不到PF6盐）
色谱柱：C18，3 μm，150x 4.6 mm；流动相A：pH =3.7的20 mM甲酸铵，流动相B：0.05%甲酸的乙腈；梯度：25 min，B：15-40%；3 min，B：40-90%；柱温：30 °C；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；紫外线检测器：280 nm和CAD；样品浓度：用50:50MeCN/水溶液配置样品，API浓度为1.0mg/mL；进样量：10 μL。
图6.顶空GC和FID检测TMU的代表性色谱图（显示了一种通用的残留溶剂分析方法中的其他常见溶剂）
表2.GC顶空参数
3.其他偶联剂
1）1,1'-羰基二咪唑（CDI）
为了寻找比碳二亚胺更好的偶联剂，从而其他偶联剂如CDI（1,1'-羰基二咪唑）和相关的羰基咪唑的开发。出于实际考虑，应注意在使用CDI时必须小心排除水分，并应避免加入的当量数过多引起副产物的生成。
使用HPLC混合模式，开发了一种确定API中残留咪唑的方法。由于相对较低的分子量和较高的极性，方法的开发具有挑战性。表3总结了方法验证，图7给出了代表性色谱图。
表3. API中残留咪唑的方法验证数据摘要
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Parameter |
Level |
Results |
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Sensitivity |
Limit of Quantitation Limit of Detection |
0.05% 0.02% |
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Linearity |
0.05% to 0.75% |
Slope: 689.2 Y-intercept:0.0 R2 = 1.00 R = 1.00 |
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Accuracy and Repeatability |
0.25% 0.50% 0.75% |
Mean (n = 3) 99.0% % RSD 1.6% Mean (n = 3) 100.3% % RSD 0.2% Mean (n = 3) 99.9% % RSD 1.0% |
色谱柱：混合模式嵌入式乙酸离子对，2 x50 mm，5 μm；流动相A：含有0.05%TFA的水，流动相B：含有0.05%TFA的乙腈；梯度：1.5min，50%B；1.5min，50-80%B；0.5min，80%B；柱温：35°C；流速：1.0mL/min；紫外线检测器：205nm；样品浓度：用50:50MeCN/水溶液稀释，API浓度为10.0mg/mL；进样量：10μL。
2）丙基膦酸酐（T3P）
T3P偶联剂有高收率和低差向异构化的特点。而且几乎没有健康或环境风险，并且产生的副产物经过简单处理可以除去。T3P将羧酸的氧转化成离子离去基团，该离去基团从产物中提取。T3P在产量，差向异构化速率，总工艺成本和安全性/毒性方面优于其他偶联剂。
使用反相HPLC建立了一种LC-MS（负电离模式）方法来确定API中残留的丙基膦酸。由于分析物的灵敏检测需要较低的紫外线吸收，因此需要LC-MS。该方法能够拆分单，二和三丙基膦酸，发现主要的残留产物是一元酸。代表性色谱图如图8所示。
色谱柱：C18，150 mm x 4.6mm，3 μm；流动相A：20 mM甲酸铵缓冲液，pH 3.7，流动相B：含有0.05%甲酸乙腈；梯度：8min，98-5% A；2 min，5% A；柱温：30 °C；流速：0.8 mL/min；进样体积：20 mL；样品浓度：用50:50流动相A/流动相B混合溶液稀释，API浓度为1.0 mg/mL；进样量：10 μL；MS检测：ESI源；模式：单离子监测（SIM离子335.10、229.10和123.00）；极性：负极。
结论
偶联剂广泛用于合成酰胺和酯。这些试剂的反应副产物在工艺开发过程中经常被忽略，因为这些副产物在结构上与原料药无关。本文讨论了许多常用偶联剂的反应副产物的来源，毒理学评估和测试方法，包括：碳二亚胺，基于胺，基于膦的试剂以及简单的偶联剂，例如1,1-羰基二咪唑（CDI）。可以为其他正在评估和控制这些副产物方面面临类似挑战的研究者提供一些有用的信息。
参考：https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/155546-Byproducts-of-Commonly-Used-Coupling-Reagents-Origin-Toxicological-Evaluation-and-Methods-for-Determination/