述评｜张晓东：抗HBV新药展望
HBV感染是世界范围内的重要公共卫生问题。全球有约2.57亿人感染HBV。感染HBV后发展为慢性乙型肝炎(CHB)的原因有：HBV为部分环状DNA病毒，血液中的HBV比较容易清除，但是组织细胞中的HBV很难清除，而且易发生免疫耐受、基因整合和基因变异。CHB有发展为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌(HCC)的风险[1]。然而，CHB很少能彻底治愈[2-3]。有力的证据表明，当前抗病毒治疗缺乏疗效是由于它们无法消除游离型HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)，而它们是病毒基因组和病毒复制的转录模板的持久形式[4-5]。较为理想的抗HBV药物应该具有良好的安全性，作用较持久且停药无反跳，激发宿主免疫应答，强效抑制病毒复制甚至清除病毒[6]。抗HBV药物可分为两类：一是直接干扰病毒复制的某一环节的抗HBV药物；二是通过阻断宿主因子与病毒相互作用以抑制病毒复制的药物。
1抗HBV药物
目前治疗CHB的方法(已上市应用于临床的药物)包括聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)和口服核苷(酸)类似物。目前在研的抗HBV药物主要分为三大类：直接抗病毒药物、免疫类药物和其他抗HBV药物。
1.1 直接抗病毒药物
完整的HBV生命周期包括附着、进入、脱衣壳、转运到细胞核、cccDNA形成、转录、翻译、包衣、组装和分泌。直接作用抗病毒的方式是针对病毒并干扰HBV复制过程(图 1)，目前主要包括7类：病毒进入抑制剂、RNA干扰剂、反义核酸药物、逆转录酶抑制剂、核衣壳蛋白抑制剂、HBsAg抑制剂和基因编辑药物等。
图1 抗HBV新药作用机制示意图
1.1.1 病毒进入抑制剂
病毒进入抑制剂一种是以细胞成分为靶点干扰HBV与细胞受体结合，另一种以病毒颗粒为靶点阻止HBV附着于肝细胞[7-8]。牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)主要表达于肝细胞的基底外侧膜[9]。有研究[10]证明，NTCP是HBV和HDV的一种功能受体，它能帮助病毒进入肝细胞，HBV表面蛋白(HBs)中的前S1区(pre-S1)被用来附着在NTCP受体上[10]。Myrcludex B是一种来源于HBsAg的HBV大蛋白(LHBs)pre-S1的合成脂多糖，作为一种入胞抑制剂抑制HBV进入细胞[11]，其可降低HBV DNA水平，安全性及耐受性均较好[12]。目前Myrcludex B在已经披露的Ⅱ a期临床试验中。此外，上海贺普药业的贺普拉肽(Hepalatide)通过与HBV肝细胞感染受体NTCP结合，阻断HBV感染。
1.1.2 RNA干扰剂
RNA干扰剂由siRNA组成，具有较高的特异性，通过干扰HBV的mRNA来减少所有HBV的转录，由于HBV是一个具有区域重叠的紧凑基因组，单个siRNA可以抑制核心蛋白、表面蛋白、聚合酶和X蛋白的产生。通过直接阻断HBV复制，间接促进HBV免疫，降低HBsAg和HBeAg的表达[13]。siRNA ARC-520是美国Arrowhead公司推出的临床首次开发的siRNA。ARC-520对HBs转录没有影响，因为ARC- 520的目标序列在核心启动子位点上游，靠近整合HBs序列的插入位点。为了解决这个问题，Arrowhead公司制造了一种针对该区域的第二代siRNA，它涵盖了整合型和cccDNA来源的HBs的转录本。这有效地降低了HBeAg阳性和HBsAg阴性的CHB患者的HBsAg水平[14-16]。目前，许多开发者，如Arrowhead和Alnylam，都有活跃的siRNA开发项目。
1.1.3 反义核酸药物
反义药物主要指反义寡核苷酸，其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA互补，抑制或封闭该基因的转录和表达，干扰致病蛋白的产生过程，即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。Ionis与GSK合作开发的反义药物IONIS-HBVRx(GSK 3228836)目前正处于临床Ⅱ期，前期临床数据显示IONIS-HBVRx对HBsAg和HBV DNA具有明显的抑制活性。此外，Aligos Therapeutics公司的ALG-020572正处于临床前研究阶段。
1.1.4 逆转录酶抑制剂
逆转录酶抑制剂是指核苷(酸)类似物，其抗HBV的机理是干扰HBV的核苷酸代谢，直接作用于病毒逆转录酶，阻断HBV复制。这些药物已成为这些年来抗病毒药物的研究热点，优点是安全、有效、易行。但核苷(酸)类药物没有抗HBsAg而产生全身性的免疫抑制的作用，因此，一旦不再治疗，病毒会再次复活，需要终身治疗，而且易引起原发性耐药或继发性耐药，一旦停药，容易反弹[17-19]，因为其抑制HBV复制，对cccDNA库没有影响。
1.1.5 核衣壳蛋白抑制剂
衣壳蛋白是用来保护HBV DNA的蛋白外壳，靶向衣壳组装和拆卸是很有前途的抗病毒策略[20]。衣壳抑制剂通过破坏核心粒子的组装从而抑制核壳蛋白合成和病毒DNA复制；或导致衣壳分解的化合物(通过中断衣壳的拆卸)都会阻碍rcDNA进入细胞核，从而阻碍rcDNA转化为cccDNA[20]。因此，核衣壳蛋白抑制剂是很有前途的抗病毒策略。
由小分子组成的抑制剂附着在核心蛋白上，引起变构调节，阻止二聚和核衣壳组装[21]。这些分子包括杂芳基二氢嘧啶、苯丙烯酰胺、吡啶酮衍生物和磺胺酰苯甲酰胺。甲磺酸莫非赛定和齐鲁制药的QL-007目前正处于临床Ⅱ期，甲磺酸莫非赛定在28天的短期治疗中，不但可以显著降低HBV DNA，而且可以有效地降低HBeAg水平。
1.1.6 HBsAg抑制剂
核酸聚合物(NAPs)通过硫代反义寡核苷酸(PS-ONs)抑制病毒复制过程中的蛋白相互作用，对包膜病毒有广泛的抑制活性。HBsAg抑制剂可以抑制感染HBV的肝细胞释放HBsAg，继而破坏HBsAg诱导的免疫机制而发挥抗病毒作用。在此领域走在前列的是加拿大的Replicor公司，分别为REP-2139(已经进入临床Ⅲ期)和REP-2165(已经进入临床Ⅱ期)。
1.1.7 基因编辑药物
灭活或消除cccDNA是降低HBV重新激活风险的唯一方法[22]。体外CRISPR/Cas9实验可以使HBV cccDNA基因编码的cccDNA和HBV蛋白水平均下降[23]。然而，为了确保对宿主DNA的最小脱靶毒性，CRISPR/Cas9必须缺乏与人类遗传物质的交叉反应性，并且必须具有将基因编辑工具专门传递至肝细胞核的能力。而且目前缺乏针对cccDNA的标准化测量(cccDNA转录本及其蛋白水平的变化)[24]。如果研究人员克服了这些障碍，那么这样的基因编辑技术就有可能根除cccDNA并实现HBV的完全治愈。虽然CRISPR也可以被设计成专门从人类DNA中去除整合的HBV序列，但是任何随后的染色体易位都会产生灾难性的后果[24]。
1.2 免疫类药物
乙型肝炎患者对HBV DNA特殊的免疫功能和对HBV DNA的免疫耐受性，以及免疫协调功能的个体差异，使HBV在体内不能被除去。免疫类抗HBV药物目前在研的有治疗性疫苗、先天免疫系统激活药物、单克隆抗体、检查点抑制剂以及其他免疫途径。
1.2.1 治疗性疫苗
治疗性疫苗是用于刺激免疫系统作为治疗的疫苗技术。治疗性乙型肝炎疫苗属于特异性主动免疫疗法，可分为蛋白质疫苗、基因疫苗和细胞疫苗三大类。临床上普遍使用重组HBsAg疫苗。GS-4774疫苗是利用重组酿酒酵母表达HBsAg、HBcAg和HBV X蛋白。GS-4774在病毒抑制的患者中耐受性很好，但它并没有显著降低HBsAg水平，即使有近一半(40%)的HBV特异性T淋巴细胞增加，影响HBcAg和HBV X蛋白[25]。
1.2.2 先天免疫系统激活药物
有证据[26-27]表明HBV蛋白被病原体识别受体识别，包括Toll样受体2 (TLR-2)、TLR-4和RIG-I。病毒可能已经进化出抑制病原体识别受体信号通路的机制。TLR-7、TLR-8或TLR-9刺激先天免疫应答的药理作用正在研究中。GS-9620是美国Gilead制药公司研发的一种TLR-7激动剂，可刺激TLR-7感知外来病原体存在、诱发免疫应答，提高抗病毒能力并获得保护性免疫。GS-9620安全、耐受性良好，但对HBsAg水平无影响[26-29]。TLR-8激动剂可以在肠道淋巴组织或肝脏中刺激触发专职抗原细胞的成熟，刺激产生的各种细胞因子可以刺激或挽救抗原特异性T淋巴细胞应答，以提高抗HBV活性。在动物模型中，TLR-8激动剂可诱导循环血细胞的先天免疫反应，而不会引起全身性的不良反应。第一个TLR-8激动剂GS-9688最近进入了Ⅱ期临床开发[30]。
1.2.3 单克隆抗体
单克隆抗体方面，韩国Green Cross(绿十字)公司的GC1102正在进行临床Ⅱ期试验，在一项前瞻性研究[31]中，证明GC1102能够降低HBsAg水平，进而获得良好的持续病毒学应答。此外，Vir Biotech的单克隆抗体Vir-3434正处于临床Ⅰ期阶段。
1.2.4 检查点抑制剂
在T淋巴细胞受体中，PD-1在肝脏内HBV特异性T细胞上表达最多，同时在肝细胞中PD-L1表达增加[32]。因此，PD-1和PD-L1抑制剂目前正被研究作为可能的治疗CHB的方法。在首次临床试验中，低剂量(单剂量0.3 mg/kg)抗PD -1中可显著降低CHB患者的HBsAg，并且有1例患者实现了完全的HBsAg血清转换[33]。我国歌礼药业/康宁杰瑞的一款PD-L1抑制剂ASC22，目前正处于临床Ⅱ期。此外，Gilead的PD-L1抑制剂GS4224正处于临床前研究阶段。
1.2.5 其他免疫途径
其他免疫类药物有Immunocore的IMC-I109V，正处于临床Ⅱ期。LionTCR的LTCR-H2-1，还在临床前研究阶段。
1.3 其他抗HBV药物
除了上述介绍外，还有一些其他抗HBV药物(附录1)，它们的作用机制各不相同。法国Enyo Pharma公司的FXR激动剂EYP001正处于临床Ⅱ期。来自我国亚盛医药的细胞凋亡诱导剂APG-1387目前正在全球范围内开展临床试验，所涉及的适应证不仅有乙型肝炎，还有晚期实体瘤和血液瘤。其他还有托普泰克公司的抗HBV X蛋白D-TTK001，Regulus的MicroRNA “HBV”，EnochianBio的基因修饰细胞疗法ENOB-HB-01，GemVax& KAEL的“新型肽段”GV1001和FinchTherapeutics的口服微生物制剂CP101均处于临床前研究阶段。
2阻断宿主因子与病毒相互作用的药物
在细胞核内，HBV cccDNA是具有细胞染色质样结构的单个小染色体[34-35]。HBV cccDNA是高度稳定的，并在肝细胞中持续存在。迄今为止，越来越多的证据[34-35]表明，表观遗传机制是造成HBV cccDNA持续性和难以清除的原因。表观遗传调控机制包括但不限于DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质重塑和非编码RNA干扰[36]。慢性病毒感染的表观遗传治疗法的研究越来越多，如人类免疫缺陷病毒、爱泼斯坦巴尔病毒[37]，表明表观遗传治疗可能是一种有前途的治疗策略。
2.1 靶向cccDNA甲基化
病毒基因组的DNA甲基化被认为是一种宿主防御机制[38]。有报道称DNA甲基转移酶(DNMT)的表达增加可以促进病毒基因组的甲基化，从而在体外阻止HBV复制[39]，这表明DNMT可以用来抑制cccDNA的转录。但是宿主DNA甲基化已被证明是肝癌中相关肿瘤抑制基因失活的主要机制[40]，因此，在开发基于DNMT的治疗方法时，应该仔细考虑阻断HBV感染和抑制宿主肿瘤抑制基因之间的平衡。对几种癌细胞系的研究表明，EGCG(-)可改变DNMT活性。此外，EGCG还被证明可以抑制HBV进入并诱导抗HBV自噬反应，这表明EGCG可能对HBV相关的HCC患者有益。据报道[41]，HBV感染诱导从头甲基化，并降低抗病毒细胞因子IL- 4的表达。此外，DNMT已被证明可上调癌症患者的细胞因子以及Janus激酶(JAK)/STAT和IFN信号通路。因此，基于DNMT的表观遗传治疗也可能唤起HBV感染细胞和免疫细胞的先天免疫，从而系统地增强对HBV复制的抑制。
2.2 靶向cccDNA的组蛋白修饰
认识组蛋白蛋白质翻译后修饰(PTMs)在cccDNA转录中的作用为抑制cccDNA提供了几个潜在的治疗靶点。尽管在cccDNA微染色体上对PTMs的全基因组绘图显示，转录活性的PTMs水平决定了cccDNA的活性[42]，而不是抑制性的PTMs；这些PTMs在宿主染色体转录中也发挥着类似的作用。因此，如果有cccDNA特异性的PTMs修饰剂，将为开发治疗靶点带来新的希望。在这方面，最近的一项研究[43]表明，一种多功能蛋白精氨酸甲基转移酶优先诱导cccDNA上的H4R3me2s抑制病毒转录，表明某些PTMs酶可能能够区分宿主染色体与HBV cccDNA的染色质修饰[43]。此外，Tropberger等[42]发现，HAT抑制剂C646阻断H3K27ac和H3K122ac的组蛋白乙酰转移酶p300/CBP，并抑制HBV转录，但在人原代肝细胞中没有细胞毒性，这为表观遗传化合物可能代表一种新型HBV抗病毒药物的概念提供了证据。
3抗HBV新药展望
HBV治疗的理想终点是消除宿主中的cccDNA，或者至少是cccDNA的完全失活，这是目前抗病毒治疗无法实现的。越来越多的证据支持cccDNA的表观遗传调控在HBV扩增中发挥重要作用。所有这些都迫切需要开发靶向cccDNA的表观遗传治疗HBV的方法，从而阻断宿主因子与病毒的相互作用以抑制病毒。为此，在cccDNA报告细胞系或HBV感染细胞培养系统中筛选可用的前药或更大的化合物库将是首要尝试的。预计在不久的将来，cccDNA特异性的表观遗传机制将得到充分阐明，并开发出治疗甚至治愈CHB的cccDNA特异性的表观药物。
针对抗HBV的单药治疗和联合治疗各有优势，但联合用药可能会成为乙型肝炎治疗的发展趋势，如果将抗HBV药物和阻断宿主因子与病毒相互作用的药物这样两个作用机制互补的药物联用，可能会更好阻止或延缓乙型肝炎的进展，可能会离功能性治愈乙型肝炎更近一步。但需要明确药物如何联合，联合治疗的最佳时机，何时停药，停药后能否反复及如何应对，预计未来会有更多基于不同机制的药物联用出现，有望成为乙型肝炎治疗的新方法。值得期待的是，随着新技术、新靶点、新疗法和新长效剂型的产生，越来越多的新分子和新化合物进入到临床阶段并取得了不错的临床效果。相信未来，能够治愈乙型肝炎的药物将会出现，乙型肝炎这个难题也终将被攻克。
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本文编辑：刘晓红
公众号编辑：邢翔宇
全网首发｜《临床肝胆病杂志》2021年第5期“抗HBV新药研发与临床研究进展”重点号（执行主编：张晓东）