解开尿结石形成的奥秘！
带你解锁尿结石形成的奥秘！
结石每一层中的分子将是具有基本功能的候选者，因此在微观水平上对结石基质进行分析是必要的。为此，使用显微 CT 进行精确定位，对肾结石进行脱矿质、切片、染色和显微镜成像。组织学染色表明结石内相邻层密度的异质性。其他结果还显示了脱钙肾石中明亮而独特的自发荧光模式，表明相邻层中的有机成分不均匀。使用激光显微切割 (LMD) 对草酸钙 (CaOx) 结石区域进行解剖以进行蛋白质分析。脱矿 CaOx 结石切片大范围区域的 LMD 产生的蛋白质与在不同 CaOx 结石样本中发现的蛋白质相同。这些创新方法将允许对异质石基质内的蛋白质组成进行空间映射。在空间上始终与矿物沉积一致的蛋白质将成为石头生长必不可少的分子的候选者。需要进行这种分析来评估结石基质中的数千种蛋白质中的哪一种可能是结石生长的基础。 我们的创新方法描述了一种研究人类肾结石的新实验室方法，通过显微镜CT分析结石基质以揭示其分子空间异质性。我们的意图是提供的数据将促进未来对结石基质的分子研究，以更好地了解导致肾结石形成的潜在机制。
1. INTRODUCTION
肾结石患病率继续增加，高达 14.8%，超过一半的受影响个体将在首次发作后 10 年内出现结石复发（Khan 等，2016）。美国肾结石治疗和管理的健康成本目前每年超过 100 亿美元（Scales 等，2016）。肾结石的危险因素——包括糖尿病、高血压和肥胖症——也在增加。令人惊讶的是，人们对肾结石生长的确切机制知之甚少。在体外培养草酸钙 (CaOx) 结石方面进行了细致的努力，包括在数周内控制成分和温度（Chow 等人，2004a，2004b），但产生的“结石”由易碎材料组成（Ananth 等人，2002 年）。无机溶液无法生产出具有肾石典型硬度的结石，这表明有机基质在结石形成中的某些作用。有人提出，石头基质的沉积是形成结石的主要因素，基质内的晶体沉积是次要事件（Boyce，1968；Boyce & Sulkin，1956）。CaOx 结石的超微结构分析表明，每个矿物晶体都被一层基质包围（Evan 等，2007；Khan & Hackett，1993）。CaOx 肾结石基质的蛋白质组学分析显示存在超过一千种不同的蛋白质（Witzmann 等，2016）。如何通过这么多可能的分子进行分类，看看哪些可能是结石生长的基础？一种方法是找出每个矿物层中存在哪些蛋白质，并假设如果蛋白质是结石生长的基础，则它必然始终存在。本研究在脱矿、包埋和切片过程中利用了结石的显微 CT 方向，并通过荧光显微镜、免疫组织化学和使用激光显微切割 (LMD) 的区域蛋白质组学对基质层进行了后续分析。这种新方法有望将普遍存在的蛋白质与仅存在于某些矿物层中的蛋白质区分开来，从而可以识别出在结石生长中具有基本功能的候选蛋白质。
2. METHODS
2.1.结石标本 作为 IRB 批准的研究 (IU IRB #1010002261) 的一部分，在内窥镜手术过程中收集了结石，或者作为从当地结石分析机构 (Beck Analytical Services) 丢弃的废料接收。这些结石在没有任何其他患者或临床特征的情况下来到我们面前。使用最终体素尺寸为 2-8 µm 的微型 CT（Skyscan 1172 Micro CT 系统；Bruker-Micro CT）对结石进行拍照、干燥和扫描。本文中报道的肾结石仅包括那些以 一水CaOx （COM，晶体名称：白钨矿）为主要矿物质的肾结石。矿物鉴定使用红外光谱方法确认（Williams 等，2010）。2.2.肾结石的制备和脱矿 肾结石嵌入 6%–7% Knox 明胶（卡夫食品）或 HistoGel（Thermo Fisher Scientific）中，并通过显微 CT 扫描以确认方向。随后，将凝胶嵌入结石浸入 1:1 比例的 5% 多聚甲醛和 10% 乙二胺四乙酸，pH 7.4，室温下，每天更新。当显微 CT 看不到结石时，认为脱矿已完成（图 1）。
Q
图1 Micro CT 可确保 Randall 的斑块结石在组织学中的正确定向和定位，并准确评估矿物质损失。（a）显微 CT 切片显示附着在 Randall（间质）斑块上的结石的外观。比例尺 = 250 µm。CaOx：草酸钙（在这种情况下，是纯 CaOx 一水合物，COM）。照片（图 b 和 c 的上部）显示了脱矿前后结石在凝胶内的整体结构。b 和 c 的下图显示了 Randall 斑块上 CaOx 结石在脱钙之前和之后的显微 CT“鬼影”图像，在该过程结束时显微 CT 没有可见性。该结石来自一位因多发性肾结石而接受双侧输尿管镜检查的患者。患者男性，78 岁，有结石病史。尿液是典型的 CaOx 结石形成者，多次 24 小时收集平均 2.9 L 体积，pH 6.61，Ca 278 mg，草酸盐 35 mg，柠檬酸盐 > 1,200 mg，CaOx 过饱和度为 4.7，CaP 为 1.6
2.3.肾结石组织学
脱矿的结石通过一系列乙醇浓度脱水、渗透并嵌入 Paraplast X-TRA (Fisher Scientific) 和 Peel-Away Micro-Cut (Polysciences Inc.) 的 1:1 混合物中。切片在 6–8 µm 处切割。苏木精和伊红 (H&E) 和 Yasue 染色用于组织学分析 (Evan et al., 2003)。还使用 Leica TCS SP8 共聚焦成像系统（在 405、488、552 和 643 nm 激发）通过荧光对肾结石的未染色连续切片进行成像，以获得天然荧光。
2.4.超分辨率自发荧光
脱钙 COM 结石基质的超分辨率自发荧光 (SRAF) 成像分析在伊利诺伊大学厄巴纳香槟分校的 Carl R. Woese 基因组生物学研究所的核心设施中运行。图像是在蔡司 LSM 880 Airyscan SRAF 系统上获取的（Sivaguru 等人，2018 年）。
2.5.免疫染色 对肾结石切片进行脱蜡和再水化，并在预热的柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 中进行抗原修复。随后，将切片与抗人 Tamm-Horsfall 蛋白（THP；Millipore）的绵羊多克隆抗体一起孵育，并在室温下储存过夜。使用与辣根过氧化物酶偶联的兔抗绵羊 IgG 二抗评估 THP 免疫反应性，并用 3,3'-二氨基联苯胺四氢氯化物水合物观察。切片用苏木精复染并使用 Leica DM3000 观察。在 Leica LMD 6 显微镜仪器的“移动和切割”模式（Micanovic 等人，2015 年）中，将宝石切片安装在薄膜载玻片上。
3. RESULTS
图2 苏木精和伊红 (H&E) 和 Yasue 染色显示结石基质异质性。(a) 脱钙 COM 结石的 H&E 显示基质异质性的证据。紧密堆积的层之间不同程度的染色强度表明整个基质中的有机物存在差异。(b) Yasue 染色也清楚地描绘了基质异质性。此外，这种染色技术可验证显微 CT 显示的结石是否完全脱矿。比例尺 = 50 µm。3.3.结石基质的天然荧光通过各种自发荧光特征揭示其分子异质性
图 3 显示了取自三名不同患者的三种不同的脱钙一水CaOx 结石，对原生基质荧光进行了成像。图 3a 显示了与图 1 相同的石头，其中脱矿结石部分的方向保持高保真度。正如我们之前在矿化斑块中所描述的那样，脱矿兰德尔斑块在远蓝色区域显示出独特的荧光图案（Winfree 等，2019）。斑块区域周围的 CaOx 显示出多个不同强度和荧光发射光谱的基质层，表明基质组成中的分子异质性。每个斑块和 CaOx 结石过度生长区域的特定自发荧光特征描述了钙化乳头状间质和肾盏含尿液空间的独特分子组成。此外，图 B 和 C 显示了另外两种具有不同天然荧光特征的 CaOx 宝石，表明 COM 有机基质内的分子异质性。
图 3 结石基质中天然荧光的异质性。(a) 脱钙的结石（来自图 1）在富含磷灰石的区域（兰德尔斑块）的远蓝色区域显示出荧光。右上插图显示了脱矿前结石的显微 CT 切片，与组织切片大致在同一平面。右下插图显示了不同强度和颜色的 CaOx 基质层的放大图。(b) 结石基质描绘了来自其他两个患者样本的不同水平的荧光强度和颜色；此外，可以看到微观有机聚集体（白色箭头）。(c) 在这块结石的基质中也可以看到荧光聚集体（白色箭头）。此外，这颗结石在相邻层之间的荧光颜色存在明显差异，表明基质成分存在明显的异质性。比例尺 = 100 µm
图 4 显示了使用 SRAF 成像（Sivaguru 等人，2018 年）对切片的、脱钙的 CaOx 结石进行的检查。高分辨率 SRAF 光学器件进一步揭示了基质的丝状性质及其异质性（图 4d-h ）。
图 4 超分辨率自发荧光 (SRAF) 成像呈现异质结石基质的更精细分辨率。(a) CaOx 石基质的低功率 SRAF 图像（蓝色 405 nm 激发，420-480 nm 发射通道伪彩色绿色，比例尺 = 20 µm）。(b) 低功率 SRAF 图像（红色 561 nm 激发，575-615 nm 发射通道伪红色）。(c) a 和 b 的合并图像。(d) c 中 d-f 盒的高功率 SRAF 图像（蓝色 405 nm 激发，420-480 nm 发射通道伪色绿色，比例尺 = 5 µm）。(e) c 中盒 d-f 盒的高倍图像（红色 561 nm 激发，575-615 nm 发射通道伪彩色红色）。(f) d 和 e 的合并。(g) 用蓝色和红色通道的合并图像放大 c 中的框 g，分别为伪彩色绿色和红色。箭头表示嵌入在结石基质中的有机聚集体（比例尺 = 5 µm）。（h）放大蓝色和红色通道分别伪彩色绿色和红色的 f 合并图像中的框 h。箭头表示绿色和红色通道重叠的位置，表示丝状石基质内的异质性（比例尺 = 5 µm）。尽管该样本的大部分由 COM 组成，但 a 到 c 中空白空间的多边形形状表明先前存在 CaOx 的二水合物形式（Sivaguru 等人，2018 年）
3.4.免疫组化染色 肾结石切片也进行了 Tamm-Horsfall 蛋白 (THP) 染色，如图 5 所示。我们的结果一致显示，CaOx 肾结石的结石基质中富含 THP（黑色箭头）和缺乏 THP 层交替出现。
图 5 CaOx 结石基质的免疫组织化学显示结石基质中的 Tamm-Horsfall 蛋白 (THP) 交替层。无一抗对照（图 a 和 c）。图 b 显示了人类肾脏切片（肾皮质）的粗升肢 (TAL) 中的 THP 反应性（黑色箭头）。用 THP 对 CaOx 结石基质进行免疫组织化学染色显示脱钙 CaOx 结石基质中富含 THP 的层（黑色箭头）和缺乏 THP 的层（图 d）。比例尺 = 50 µm。该样本具有混合成分（86% COM、7% 尿酸和 7% 磷灰石）。患者接受了双侧经皮术，24 小时尿液分析平均 1.8 L，pH 6.10，Ca 241 mg，草酸盐 49 mg，柠檬酸盐 747 mg，CaOx 过饱和度为 8.1，CaP 过饱和度为 1.38
3.5.使用 LMD 的区域蛋白质组学 CaOx 结石试样的 LMD 过程如图 6a 所示。用于蛋白质组学分析的 LMD 样品的平均面积为 1.64 × 106 µm2，这些样品平均产生 629 种不同的蛋白质。当对大约 100 毫克 CaOx 石粉进行并发蛋白质组学分析时，我们确定了这 629 种蛋白质中的 464 种。无标记定量分析显示 LMD 和粉状结石样品之间的相对蛋白质丰度有很强的相关性（图 6b），从而验证了基于 LMD 的蛋白质组学方法。表 1 总结了来自图 6c 的层次聚类分析的 LMD 和粉碎的 CaOx 肾结石样品中的 20 种最丰富的蛋白质。
图 6激光显微切割 (LMD) 有助于 CaOx 结石的蛋白质组学空间映射。(a) LMD 的过程在蛋白质提取的前后 (黑色箭头) 面板中说明 (比例尺 = 50 µm)。(b) CaOx 石粉和 LMD 切片中鉴定的蛋白质通过它们的相对无标记定量值 (LFQ) 相互绘制。(c) 无监督层次聚类，突出了在 LMD 和粉状 CaOx 结石样本中鉴定的最丰富的蛋白质。
表格1激光显微切割和粉状草酸钙结石样品中含量最高的 20 种蛋白质。通过无监督的层次聚类，根据它们的无标记定量值，将鉴定的蛋白质按丰度顺序列出。请注意，Tamm-Horsfall 蛋白（也称为尿调节蛋白）是已鉴定的前五种蛋白质之一
血红蛋白亚基β (HBB)
血红蛋白亚基α (HBA2)
15-羟基前列腺素脱氢酶 [NAD+] (HPGD)
脂肪酸合成酶 (FAS)
尿调节蛋白 (UMOD)
肌球蛋白-9 (MYH9)
骨桥蛋白-D (SPP1)
微管蛋白 Beta 链 (TUBB2C)
热休克蛋白 HSP 90-alpha (HSP90AA1)
微管蛋白α链补体 C3 (C3)
纤维蛋白原α链（FGA）
维生素 K 依赖性蛋白 Z (PROZ)
热休克蛋白 HSP 90-beta (HSP90AB1)
纤维蛋白原伽马链 (FGG)前表皮生长因子 (EGF)
甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶 2 (MASP2)
囊泡整合膜蛋白 VIP36 (LMAN2)
Coronin-1B (CORO1B)
Beta-1,4, 半乳糖基转移酶 1 (B4GALT1)
Beta‐1,4,galactosyltransferase 1 (B4GALT1)
4. DISCUSSION
这里描述的工作说明了一种研究肾结石基质和探索其分子（有机）含量的创新方法。尽管研究人员之前已经证明了对肾结石进行脱矿和切片以研究有机基质的可行性（Chow 等人，2004a），但我们不仅优化了这种组织学技术，而且通过有条不紊地应用两种新颖的关键技术来扩展其效用：(a)显微 CT 用于评估结石的脱矿程度，更重要的是，用于准确定位和定向肾结石以进行组织切片，(b) LMD 用于分析结石基质的特定感兴趣区域。此外，我们通过使用激光显微切割样品产生重要的蛋白质组学数据证明了这些创新方法的优势，并证明了与粉碎的石头样品一致的强大的蛋白质组学相关性。将组织化学和蛋白质组学技术应用于肾结石的能力可以进行深入的分子研究，这种研究以前从未被证明过，应该有助于了解结石生长的开始和传播。CaOx 结石中的有机基质似乎是异质的。这在荧光图像（图 3 和 4）中尤为明显，表明相邻层中基质的性质可能不同。值得注意的是，具有大部分尿酸成分的混合肾结石也通过组织学染色和自体荧光显示出明显的异质性（图 S1）。对 THP（最丰富的尿蛋白）进行免疫组织化学分析的初步工作（图 5）显示，结石基质层可能缺乏或富含 THP（图 S2）。这表明，THP 不太可能是一种对结石生长必不可少的尿蛋白，因为它在结石的某些层中是检测不到的。在这些使用 LMD 切片的初步研究中发现的蛋白质数量和多样性与先前针对较大石头标本发表的内容一致（Witzmann 等人，2016 年）。结石基质中存在如此大量不同的蛋白质还有待解释，但尿液中的许多蛋白质可能以非特异性方式成为结石基质的一部分。有人提出某些蛋白质是结石形成的关键（Boyce，1968），而其他蛋白质可能只是通过结石长期暴露于尿液中而积累（Witzmann 等，2016）。如果是这种情况，那么找出哪些蛋白质是关键的，哪些是偶然的就很重要了。对脱矿结石的 LMD 切片进行蛋白质组学分析，开启了对单个结石内特定层进行分析的可能性。这样的工作应该能够识别所有石头层中存在的蛋白质。然后，这些蛋白质将成为重点研究其对矿物沉积影响的候选者，可能使用一种现代方法，允许在体外对矿物生长进行微观监测（Singh 等，2017）。
未来对结石基质的研究将有助于描述矿物和有机层沉积的机制。结石蛋白质组的空间映射无疑将有助于更好地了解结石形成，包括肾锚定机制（即兰德尔斑块和/或导管堵塞）。因此，这些新技术的利用和优化可以开始解开 CaOx 矿物引发和生成的奥秘。
译者简介
吕建林教授的专著