FrontiersinImmunology|TCR作为宫颈癌患者免疫监测和预后评估的新指标
摘要：
研究选取了25位宫颈癌（CC）患者，30位宫颈上皮内瘤变（CIN）患者和20位健康女性，获得外周血样品的TCR库，以了解免疫过程中宫颈癌变的免疫变化。另外还探讨了16例CC患者在宫颈肿瘤组织和成对的前哨淋巴结中TCR成分的特征及其在预测患者预后中的潜在价值。结果表明，在宫颈癌的发生和发展过程中，循环TCR的多样性逐渐降低，且CC患者的循环TCR库与健康女性相比更类似于CIN患者。在CC患者中唯一检测到的几种克隆型倾向于共享相似的CDR3序列，这与在CIN患者中观察到的不同。此外，CC患者前哨淋巴结中TCR的多样性高于肿瘤组织。更重要的是，前哨淋巴结TCR中的较少的克隆型与患者预后差有关。总体而言，研究发现表明TCR可能是免疫监测的潜在指标，也是预测CC患者预后的生物标志物。
背景：
宫颈癌（CC）是全球女性中第四大最常被诊断出的癌症。而高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是宫颈癌产生的主要原因。在人类中，大多数TCR都由α和β链组成。TCRβ链是通过可变（V），多变（D）和连接（J）基因片段的随机重组产生的，从而产生了高度多样的互补决定区3（CDR3），这对于抗原识别的特异性和亲和力至关重要。CDR3多态性说明了TCR多样性，并允许T细胞靶向任何内源性或外源性抗原。T细胞将通过识别与疾病相关的抗原而被特异性激活和扩增，从而导致TCR的分布出现差异。因此，对TCR库的分析可用于反映患者的免疫反应。已有一系列研究证实TCR可以作为监测免疫反应的生物标记物，然而TCR库的特征包括多样性和相似性及其在CC患者中的预后意义仍然未知。
结果：
1.CC，CIN患者和健康女性外周血样本中的TCR多样性
结果数据表明，CC患者的特异性氨基酸序列数明显低于CIN患者和健康女性（图1A）。在CC患者中，TCR的多样性（Shannon）最低，其次是CIN患者，在健康女性中最高，这表明在宫颈癌变过程中，循环TCR多样性逐渐降低（图1B）。CC患者中前10种克隆型的比例高于CIN患者和健康女性，而在健康女性中观察到更多的低频序列（图1C）。TCR库的Shannon多样性指数与最大优势克隆的频率呈负相关关系（图1D）。这些数据加在一起表明，TCR多样性的降低是通过克隆型的高频扩增的出现而反映出来。
图1
2.CC患者外周血TCR多样性与临床特征的关系
晚期CC患者的TCR多样性显著低于早期CC患者（图2A），提示外周血TCR多样性随CC患者的病情发展而降低，这也支持了在宫颈癌变过程中循环T细胞库多样性逐渐降低的结论。但是，鳞状细胞癌和腺癌亚组之间未观察到TCR多样性的显著差异（图2B），不同年龄组之间也无显著差异（图2CD）。此外，在CIN-I，CIN-II和CIN-III亚组之间多样性也未观察到显着差异（图2E），表明外周血TCR多样性无法区分CIN患者的不同程度病变。
图2
3.CC，CIN患者和健康女性外周血TCR库中V J基因的使用情况
在65种V基因的使用中，有8种在三组之间存在显著差异（图3A），除了V5.8和V20.1外，健康女性中其余六个V基因的使用频率显著高于CC和CIN患者，且CC和CIN患者之间无显著差异。主成分分析（PCA）的结果还表明，这些V基因中健康样本可以与CC和CIN样本清晰的分开，而CC和CIN样品则部分重叠（图3B）。这些结果表明CC和CIN患者中V基因的使用更为相似。此外，还比较了CC，CIN和健康人群之间J基因的使用情况，以及TCRβ CDR3 aa序列的长度分布，各组之间J基因的没有使用差异。各组之间的CDR3长度分布也相似，且CDR3平均长度无显著差异（图3CD）。
图3
4.组内或组间外周血TCR的相似性
通过计算同一组内的样本之间以及三个不同组之间的TCR重叠，进一步评估了TCR的相似性。发现任意两名CC患者的平均重叠率均显著高于CIN患者和健康女性（图4A）。且CC和CIN患者之间的平均重叠显著高于CC患者和健康女性之间的平均重叠以及CIN患者与健康女性之间的平均重叠（图4B）。这些结果表明，组内TCR的重叠大于不同组之间的重叠，CC患者的外周血TCR比健康女性更接近CIN患者。搜索仅在CC患者中存在但在CIN患者和健康女性中不存在的克隆型，以鉴定针对CC的免疫应答特征，这些特征被定义为CC患者的疾病相关克隆型。总共识别出887种与CC相关的CC型患者的克隆型，其中8种在30％以上的CC患者中被发现。同时也查找了仅在CIN患者中存在但在CC患者和健康女性中不存在的克隆型，结果表明，CC患者的疾病相关克隆型具有与CIN患者不同的相似CDR3基序（图4C）。
图4
5.CC或CIN患者中发现的与疾病相关的克隆型
为了解CC患者组织样品中T细胞的克隆表达，使用TCRβ CDR3独特的氨基酸（aa）序列数和Shanoon多样性指数比较肿瘤组织和配对前哨淋巴结之间的TCR多样性。结果显示，在肿瘤组织中，TCRβ CDR3独特氨基酸序列的数目和Shanoon多样性指数均显著低于成对的前哨淋巴结（图5AB）。在肿瘤组织或前哨淋巴结中，年龄对TCR多样性也没有影响（图5C）。此外，比较肿瘤组织和前哨淋巴结之间的V和J基因使用情况的差异，结果显示，前哨淋巴结中的V5.1，V5.3，V5.4，V5.5和V6.9基因使用频率显著高于肿瘤组织（图5D），这意味着肿瘤组织中有TCR的独特V基因使用模式。
图5
6.肿瘤组织或前哨淋巴结中的TCR库与CC患者的预后之间的关系
在手术后不同疾病状态的患者中，比较肿瘤组织或前哨淋巴结中独特的aa序列数和Shonnon多样性指数，以及肿瘤组织和成对的前哨淋巴结之间的TCR重叠。结果表明，疾病进展患者的前哨淋巴结中独特的aa序列数显著低于非疾病进展患者的前哨淋巴结（图6A），这说明前哨淋巴结TCR中的克隆型较少与CC患者的预后不良有关。然而，在疾病进展的患者之间，肿瘤组织中特异性氨基酸序列的数目，肿瘤组织或前哨淋巴结中的Shannon多样性指数以及肿瘤组织与成对的前哨淋巴结之间的TCR相似性没有显示出任何显著差异。（图6B-E）
图6
总结与讨论：
本研究首次使用高通量TCR序列来描述宫颈癌（CC）患者外周血、肿瘤组织和配对前哨淋巴结中TCR的特征。发现在宫颈癌发生和发展过程中循环TCR多样性逐渐降低，但宫颈癌患者中循环TCR与宫颈上皮内瘤变（CIN）患者的相似度高于健康女性。此外，在宫颈癌患者中检测到几种特异性克隆型，它们倾向于共享相似的CDR3序列。此外，还发现CC患者的正常前哨淋巴结的TCR多样性高于肿瘤组织。有趣的是，在正常前哨淋巴结中检测到的克隆型数量与患者的预后相关，克隆型越少，预后越差。现在越来越多的证据表明，TCR序列多样性可能作为抗肿瘤适应性免疫的潜在生物标志物和癌症治疗反应的预测标志物。
参考文献
[1].Cui JH, Lin KR, Yuan SH, Jin YB, Chen XP, Su XK, Jiang J, Pan YM, Mao SL, Mao XF, Luo W. TCR Repertoire as a Novel Indicator for Immune Monitoring and Prognosis Assessment of Patients With Cervical Cancer. Front Immunol. 2018 Nov 22;9:2729. doi: 10.3389/fimmu.2018.02729. PMID: 30524447; PMCID: PMC6262070. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30524447/