Digital Western Blot在领先靶向蛋白降解药物公司研发中应用
靶向蛋白质降解
蛋白表达和功能异常调控可极大地改变细胞生理学并导致许多病理生理状况如癌症、炎症性疾病和神经退行性疾病等。内源性蛋白质的稳态表达由从头合成和降解速率的平衡来控制。靶向蛋白质降解（Targeted Protein Degradation，TPD）以剂量和时间依赖性方式通过蛋白酶体对致病靶蛋白进行降解。从目前药物研发进展来看，靶向蛋白降解的概念提供了革命性的药物开发机会，预计将带来现代小分子药物研发的转变。
在靶向蛋白降解领域，蛋白质免疫印迹技术（Western Blot，WB）是观察细胞中浓度依赖性蛋白质降解的经典方法。然而，传统的蛋白质印迹非常耗费资源，需要多个洗涤步骤和长孵育时间才能产生高质量的印迹，导致技术操作复杂、通量低、定量不准和重复性差等劣势，难以推动选择性诱导、快速和可持续性的蛋白质降解疗法的快速发展。
根据药物研发需求，工业界迫切需要建立高效、灵敏、可量化和可重现的蛋白质降解技术平台，满足不同通量和不同研发阶段需求。目前全球领先的靶向蛋白质降解药物研发公司基本建立了高低通量结合、筛选和验证一体化的研发平台。下面文章一窥行业领先的药物公司平台建设思路。
SLAS Discovery：C4 Tx团队总结加速靶向蛋白降解疗法开发和优化的高通量技术
本文总结了靶向蛋白降解领域最常采用的从低通量到高通量的几种不同方法。详细说明了传统Western blot、基于毛细管电泳技术的Digital Western Blot（ProteinSimple）、高通量流式细胞术（HTFC）、AlphaLISA SureFire技术、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)技术和Nano-Glo HiBiT技术。
01
Digital Western Blot技术
Digital WB技术是传统WB实验系统的高效替代方案。使用该技术，可在同一根毛细管中完成样品分离、捕获、固定、免疫检测和定量分析，从而实现传统WB的所有实验步骤（包括蛋白质上样、分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据分析）自动化，有效提高蛋白质表达定量结果的精确性和重复性。全自动Digital WB技术显著地缩短了样本检测时间到3小时，直接采集化学发光或荧光信号值，利用数字化信号峰面积来表征蛋白含量，短时间内实现了目的蛋白的可视化精准定量分析。ProteinSimple旗下具有系列的Digital WB系统，从25到96个样本通量，可满足靶向蛋白降解药物研发过程中对中低通量检测需求。
本技术可相对和绝对定量检测目的蛋白丰度，适用于内源性的或未修饰靶蛋白分析，如果抗体表位不受干扰，也可检测修饰的标记过的蛋白质。与传统WB相比，Digital WB可实现高分子量蛋白质可靠捕获和定量分析如BRD4案例。同时，需要样本量少，只需要3 μL上样量，特别适用于细胞或降解剂有限的条件下，96孔板中收集处理过的细胞可满足检测需求。除了自动化和标准化之外，批次数据差异CV值较低，重复性好。软件符合21 CFR Part11，数据全程可记录。这些优势使其成为工业领域蛋白表达检测平台的标准配置。
02
高通量流式细胞术（HTFC）和In-Cell Western (ICW)
流式细胞技术可分析细胞表面和细胞内蛋白质表达水平，技术进步已使流式可作为中高通量筛选方法来辅助药物发现。紧凑型流式细胞仪可检测96孔板中细胞配体或蛋白质的不同荧光强度。本质上，高通量流式细胞术一次检测单个细胞，提供单个细胞信号。而ICW对孔内所有细胞进行批量读取。两种方法使用比率荧光读数来提高重现性和降低标准偏差，进而提高整体数据质量。与传统流式比，这两种技术方案需要更少的样本体积和检测抗体可有效降低成本。但无法根据蛋白质分子量参数来区分特异性和非特异性信号。
03
AlphaLISA SureFire技术
AlphaScreen是一种多功能的基于微珠相互靠近实验技术，基于生物分子的相互作用，可测定各种分析物包括标记的或内源性蛋白。本技术提高了检测灵活性，微珠种类被设计识别各种不同的工程化蛋白质标签，或AlphaLISA每个微珠能包被针对目标蛋白不同表位的特异性抗体。当与同一蛋白质结合时，Alpha供体和受体微珠会靠近，采用680nm近红外光激发，供体微珠导致单线态氧分子释放。单线态氧的产生本身不足以产生信号，但当受体微珠靠近时，会引发能量转移反应，进而产生放大的荧光信号。AlphaLISA SureFire技术采用改进光谱特性的微珠，只能进行终点分析，需要细胞裂解来观察感兴趣蛋白质信号。对于时效性降解曲线，可通过多个高通量筛选细胞培养板在不同时间点裂解来实现。该技术优势是有助于更快地优化、自动化和小型化，适用于化合物常规和高通量筛选。可减少实际操作时间和信号读取需要的总时间，加速药物发现。具有飞克级灵敏度和 4-5 log 宽动态范围，使其适合于细胞内、分泌或膜结合蛋白检测。
对于靶向蛋白质降解的细胞学实验，384孔板可显著缩短实验时间。使用合适的抗体，通过使用针对靶蛋白翻译后修饰的抗体来区分靶标蛋白。例如使用特异性识别磷酸化蛋白的抗体直接评估具有自磷酸化活性激酶的化合物BiDAC抑制和降解影响，可与总蛋白（磷酸化和未磷酸化）测量值进行比较。获得这两个数据可能会提高降解剂与抑制剂前体区分机制的理解，进一步了解目标蛋白调节对表型影响。
尽管有这些优点，该技术有一些局限性。Alpha 微珠价格昂贵且对环境光高度敏感，需要在暗室环境添加实验试剂，上机前孵育期间尽可能避免在光线下长时间暴露。此外，读板机温度会影响单线态氧的生成和扩散速率，每摄氏度可高达10%。为了最大限度地减少批次间差异，实验微孔板和读板机应保持在温度良好可控环境中。最后需要注意过渡金属可导致单线态氧猝灭效应。
04
时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)实验
TR-FRET实验可用于检测细胞内蛋白质水平变化，有助于高效快速的靶向蛋白质降解领域的药物发现。与AlphaLISA SureFire 技术类似，TR-FRET 是一种直接的均质混合和读取夹心免疫分析方法，信号检测前不需多次洗涤步骤。通过量化两种荧光团标记的抗体之间的比率信号来确定蛋白降解水平，这些抗体结合同一蛋白质上的两个不同表位，采用供体和受体荧光团标记。
TR-FRET是终点实验，需要细胞裂解来观察检测感兴趣蛋白质的信号。如蛋白降解动力学曲线，必须使用多个高通量筛选细胞板并行设计TR-FRET实验，以便裂解细胞并在每个时间点后添加检测抗体。将这些数据叠加可提供DC50、Emax偏移以及时效曲线。对于生物标志物分析，重要的是两种抗体使用不同表位与同一蛋白质结合，以启用 FRET 信号，同时将背景信号降至最低。与Alpha 技术一样，该方法可用于测量目标蛋白质翻译后的抑制，从而可对通路抑制以及总蛋白质水平进行定量。也可区别癌症样本突变体和正常组织中相同蛋白质野生型具有选择性的降解剂。本技术需要购买高质量特异性抗体，长期药物发现工作时，TR-FRET 分析每个数据点成本可能是该技术的最大缺点，尽管成本可通过批量定制标记抗体降低。TR-FRET实验的灵活性、适应性和可转移性具有优势。一旦针对某个细胞系靶蛋白的 HTRF方法建立，通常很容易转移到表达相同蛋白质的其他细胞系中。HTRF技术具有宽动态范围和信号稳定，而无需担心环境光的猝灭效应。
05
Nano-Glo HiBiT技术
Nano-Glo HiBiT技术是一种高通量靶向蛋白质降解药物筛选系统。本技术基于分成两部分互补NanoLuc荧光素酶系统，11个氨基酸的HiBiT标签和 17.6 kD LgBiT多肽。采用 CRISPR基因编辑技术将11个氨基酸的 HiBiT标签引入到编码目标蛋白基因内，或设计为可通过质粒转染或慢病毒感染的重组DNA表达载体，两种方式都可实现将标签与感兴趣目的蛋白相连。加入特有的裂解检测试剂，HiBiT会自发的与检测试剂中与HiBiT互补的多肽LgBiT结合，二者结合后可形成有催化功能的NanoLuc 荧光素酶，可催化底物产生明亮的发光信号。该信号强度与细胞裂解物中的 HiBiT 标记蛋白含量成正比。
本技术检测蛋白质浓度线性范围有几个数量级，产生的发光信号可稳定数小时，因此适用于蛋白质降解剂药物发现阶段的高通量筛选。将HiBiT标签基因编辑敲入到感兴趣的蛋白质序列中，并生成稳定表达 HiBiT 标签目的蛋白的细胞系，整个实验开发时间至少需要3-4周。如需要挑取高表达HiBiT信号的单细胞克隆，则这个系统开发时间额外增加2-3周。与不需要基因编辑开发表达HiBiT细胞系技术相比，开发时间长是这种方法的一个缺点。然而，一旦产生稳定表达的具有足够信号的细胞克隆或细胞群，操作只需加样、直接均匀混合和读取检测，比较简单。
HiBiT 技术也可进行实时动力学蛋白降解检测。LgBiT蛋白通过慢病毒转染到已经表达HiBiT标记的目标蛋白细胞中，同时表达HiBiT和LgBiT标签，整个实验过程中重组发光NanoBiT酶都存在，通过与特定底物作用来检测信号随时间变化值。作为单一的非裂解试剂添加步骤，持续几分钟到几小时到几天时间内实时测量目的蛋白质降解，所以这种方法检测板和HiBiT试剂成本方面更具成本效益，但长时间实验需要配置自动化系统。
靶向蛋白质降解平台建设策略
纵观目前市面上几种不同通量的靶向蛋白质检测技术，每种技术都各自优势和相关局限性。如何构建高效的靶向蛋白质降解技术平台来推动药物发现计划，需要注意整体策略选择，综合考虑成本、时间和可行性等多种因素。根据具体研发目标，选择最可能受益技术方案。针对某些靶标蛋白可能需要采用分层筛选漏斗原理，根据C4团队的经验，这种分层方法可最大限度地提高数据收集效率，以推动BiDAC降解剂早期发现和优化工作。各种策略前提是针对目标蛋白的抗体，及所有检测方法和试剂都必须在化合物筛选前完整验证。如有Nano-Glo HiBiT技术平台，可作为快速优化降解剂效力的高通量筛选的首选方法，它适用于终点法和连续读取方法，以与TR-FRET相当的成本，但提供更多的数据类型和检测灵活性。如有针对目的靶标高度特异性且经过验证的抗体，同时有相关即用型试剂盒，TR-FRET是一种合适的高通量药物发现工作的替代方案。TR-FRET可为表达相同目标蛋白的不同细胞系后续筛选提供有吸引力的选择。具体那种方案作为高通量筛选阶段优先选择，取决于研发阶段和目标。
本团队建议高通量筛选平台需与其他技术平台配合使用，才能更充分表征异双功能蛋白降解剂。如采用Digital WB确认内源性蛋白质降解，以确保与初步筛选实验中利用HiBiT高通量技术获得一致性实验结果，防止初级筛选试验中数据结果被错误解读。不管首选策略是什么，随着未来几年靶向蛋白降解领域的研究不断加强，利用更高通量技术和更自动化平台来加速药物发现是一项有价值的投资。
SLAS Discovery：C4 Tx团队开发一种小分子诱导泛素化动力学检测方法
目前大多数靶向蛋白降解化合物借助最常见的E3泛素连接酶，主要是Cullin环连接酶CRBN或VHL。化合物在E3连接酶和靶蛋白之间形成三元复合物，并促进E3连接酶催化靶蛋白泛素化，多泛素化靶蛋白随后被细胞蛋白酶体降解。BiDACs以催化方式驱动靶蛋白泛素化，时间依赖性的诱导靶蛋白持续降解。作为新兴的治疗策略，理解蛋白质降解的催化基础对于靶向蛋白质降解表征和效用至关重要。
依赖CRBN双功能蛋白降解化合物（BiDAC）的催化速率是药物发现过程中需要考虑的重要参数。C4基于毛细管的全自动数字化WB技术，开发了一种无细胞裂解物泛素化的体外系统来检测BRD4溴结构域1（BD1）泛素化的动力学。采用全自动Digital WB来进行BD1和BRD4泛素化水平，研究发现 BiDAC 在泛素化速率、亲和力和协同性方面存在显着差异，并遵循快速平衡模式。此外，量化发现不同化合物之间泛素化模式有所不同。本研究提供一个框架来优化BiDAC，进而提高三元复合物形成亲和力和泛素化率。只有在形成稳定的靶蛋白-BiDAC-E3泛素连接酶三元复合物时才能高效特异性泛素化靶蛋白，但三元复合物形成不一定决定泛素化率。通过检测无细胞裂解物中BD1结构域泛素化初始速率，来了解相同化学系列BiDAC是否在催化效率方面和热力学参数方面差异。
下图A中 3个化合物CFT-0251，CFT-0743和CFT-0660在不同浓度下，90min时BD1泛素化免疫印迹条带。下图B中用 DMSO或300nM CFT-0251处理样品，不同时间点的BD1和 BD1_Ub代表性化学发光定量峰图。通过Digital Western检测在4个时间点，根据每个时间点获得的曲线下峰面积AUC测量BD1转化为泛素化偶联BD1的量。90分钟时间内DMSO对照显示很低背景泛素化水平。相比之下，CFT-0251在300nM浓度时泛素化水平最高，BD1在整个实验过程中发生明显的泛素化，进而导致蛋白降解。
BiDAC诱导的BD1泛素化水平在不同泛素化位点可变的。下面A图 BD1泛素化模式量化10个化合物对BD1结构域无赖氨酸泛素数量。随着时间变化，最大活性浓度下测试各种BiDAC，只有CFT-0743结果双泛素化比单泛素化更多。
了解泛素化率有助于深入了解BiDAC系列化学过程，可优化E3连接酶降解目标蛋白质过程。特别是对于挑战性的目标蛋白，其中泛素化率可能被证明是需要优化的关键参数。需要开发定量描述热力学和降解动力学的方法工具，来全面了解BiDAC诱导的蛋白质降解过程以及循环的每一步对整体降解速率的影响。
降解标签（dTAG）技术验证蛋白质降解靶标
常规的靶标确认策略包括RNAi或 CRISPR/Cas9破坏基因表达，从而导致细胞总蛋白水平降低 ，或使用小分子拮抗剂抑制蛋白功能。小分子药理学方法较单纯的基因方法具有许多优势，包括剂量依赖性效应以及快速且可逆的作用。相比之下，基因方法提供的动态控制较少、无法确定有效剂量且通常完全不可逆。dTAG 靶标确认技术结合了基因和药理学策略的技术优势，可快速提供细胞总目的蛋白丰度的剂量依赖性效应，且在降解剂洗脱方面，这种效应是可逆的。靶向蛋白降解剂会敲低整个蛋白质，影响蛋白功能。因此，新的降解剂开发需要评估潜在靶点，靶点验证是一项重要工作。dTAG降解技术提供了一种可复制推广的策略，原则上可降解任何细胞内感兴趣的蛋白质（POI）。它主要优点是不依赖于蛋白配体或PROTAC的预先存在，具有广泛地适用性，使其成为蛋白靶标发现和确证的有效策略。
dTAG 的作用机理
通过CRISPR/Cas9 介导的基因座特异性敲入或慢病毒转基因表达，靶蛋白表达为一种具有 FKBP12F36V 突变体的嵌合体。dTAG-13等 dTAG 化合物由一个高选择FKBP12F36V 配体与 E3 连接酶配体连接组成，该配体在融合蛋白和 E3 连接酶之间形成一个三元复合体，从而引起靶蛋白多聚泛素化和降解，dTAG-13 已被用来检测和验证癌症新靶点。
下图利用dTAG降解剂处理表达FKBP12F36V 融合蛋白，评估探索剂量依赖性降解反应。利用Digital WB检测蛋白降解水平，最高剂量500nM下观察到最大降解。在这种情况下，与 5nM dTAG-13 处理相比，用相应的阴性对照 (dTAG-13-NEG) 处理似乎略微降低了目标蛋白水平。A图CRBN募集dTAG降解剂dTAG-13，B图是VHL募集的dTAG降解剂dTAGV-1。与 dTAG-13处理一样，观察到剂量依赖性降解，最高测试剂量 (500 nM) 下观察到最大降解。右图条带图和峰面积图定量数据显示两个dTAG降解剂之间的灵敏度差异。与 dTAG-13相比，用dTAGV-1处理后的降解更敏感，在这种情况下，dTAGV-1将用于后续实验的首选降解剂。
采用dTAGV-1处理野生型FKBP12和FKBP12F36V 靶标2细胞，Digital WB可直接反应融合蛋白与野生型分子量变化，同时准确检测dTAGV-1剂量依赖性降解反应。
通过以上案例，可知传统免疫印迹方法重复性较差、定量不准确和操作时间长等技术限制，很难满足蛋白泛素化水平检测和靶标验证的精准定量需求。Digital WB技术是基于毛细管电泳的快速定量免疫学检测方法，可检测靶蛋白和泛素化蛋白表达水平，进而准确反应靶向蛋白降解研究过程量效关系和时效关系。Digital WB技术可灵敏地、快速地、可重复性确认内源性蛋白降解，以确保与初步筛选实验中高通量技术获得一致性实验结果，是RPOTAC技术平台构建的必备技术。已被GSK、Pfizer、Arvinas、Kymera therapeutics、C4 therapeutics，药明康德和康龙化成等领先RPOTAC药物研发和服务公司采用。
PROTAC 是 Arvinas, Inc. 的注册商标，BiDAC是C4 therapeutics的注册商标。其他商标和注册商标是其各自所有者的财产，本文引自如下文献：
1. Jeffrey R. Simard, Linda Lee etc. (2021). High-Throughput Quantitative Assay Technologies for Accelerating the Discovery and Optimization of Targeted Protein Degradation Therapeutics. SLAS Discovery. Vol. 26(4) 503–517
2. Ellen F. Vieux, Roman V. Agafonov etc. (2021). A Method for Determining the Kinetics of Small-Molecule-Induced Ubiquitination. SLAS Discovery. Vol. 26(4) 547–559