Molecular Cell |斯坦福大学齐磊实验室开发出“迷你”CRISPR基因组编辑系统“CasMINI ”
CRISPR基因编辑的常见类比是，它像分子剪刀一样工作，切割DNA的特定部分。斯坦福大学(Stanford University)生物工程助理教授齐磊(Stanley Qi)喜欢这个类比，但他认为是时候把CRISPR重新想象成一把瑞士军刀。
然而，许多不同的 CRISPR 系统正在使用或正在进行眼、肝和脑疾病的基因治疗的临床测试，它们的范围仍然有限，因为它们都有同样的缺陷: 它们太大，因此，太难输送到细胞、组织或活的有机体中。
在9月3日发表在《分子细胞》杂志上的一篇论文中，Lei Stanley Qi 亓磊和他的合作者宣布了他们认为 CRISPR 向前迈出的重要一步: 一个高效的、多功能的、小型的 CRISPR 系统。
Bioengineers have repurposed a 'non-working' CRISPR system to make a smaller version of the genome engineering tool. Its diminutive size should make it easier to deliver into human cells, tissues and the body for gene therapy.
目前普遍使用的 CRISPR 系统——名称为 Cas9和 Cas12a，表示不同形式的 CRISPR 相关蛋白质(Cas)——由大约1000到1500个氨基酸组成，而它们的“ CasMINI”含有529个氨基酸。
研究人员在实验中证实，CasMINI 可以删除、激活和编辑遗传密码，就像它强壮的对应物一样。体积更小意味着它更容易进入人体细胞和人体，使其成为治疗各种疾病的潜在工具，包括眼疾、器官退化和基因疾病。
坚持不懈的努力
为了使系统尽可能小，研究人员决定从 CRISPR 蛋白 Cas12f (也称为 Cas14)开始，因为它只包含大约400至700个氨基酸。
然而，像其他 CRISPR 蛋白一样，Cas12f 天然地来源于古生菌——单细胞生物——这意味着它不适合哺乳动物细胞，更不用说人类细胞或身体了。目前已知只有少数 CRISPR 蛋白质不经修饰就能在哺乳动物细胞中发挥作用。不幸的是，CAS12f 不是其中之一。这对于像齐医生这样的生物工程师来说是一个诱人的挑战。
“我们认为，'好吧，数百万年的进化还不能使这个 CRISPR 系统在人体内发挥作用。我们能在一两年内改变这种状况吗？”他说。“据我所知，我们第一次把一个无法工作的 CRISPR 变成了一个可以工作的 CRISPR。”
事实上，实验室的博士后学者，论文的第一作者XiaoshuXu，在人类细胞中没有发现天然 Cas12f 的活性。徐和齐推测，问题在于人类基因组 DNA 比微生物 DNA 更复杂，更难以获得，使得 Cas12f 很难在细胞中找到其目标。
通过观察 Cas12f 系统的计算预测结构，她小心地选择了大约40个蛋白质突变，这些突变有可能绕过这个限制，并建立了一条同时测试许多蛋白质变体的管道。理论上，一个有效的变体可以通过激活人类基因组中的绿色绿色荧光蛋白(GFP)使人类细胞变成绿色。
“一开始，这个系统根本不起作用,”徐。“但是在反复的生物工程之后，我们看到一些基因工程蛋白开始启动，就像魔术一样。它让我们真正认识到合成生物学和生物工程的力量。”
第一个成功的结果是温和的，但是他们让徐，并鼓励她向前推进，因为这意味着这个系统工作。经过多次迭代，她能够进一步改善蛋白质的性能。“我们开始只看到两个细胞显示绿色信号，现在经过工程处理，在显微镜下几乎每个细胞都是绿色的,”徐说道。
“在某个时刻，我不得不阻止她,”Lei Stanley Qi 回忆道。“我说，'目前这样很好。你做了一个很好的系统。我们应该考虑这种分子如何应用。'"
除了蛋白质工程，研究人员还设计了 RNA，引导 Cas 蛋白到达其目标 DNA。对这两种成分的修饰对于使 CasMINI 系统在人类细胞中工作至关重要。他们测试了 CasMINI 在实验室人类细胞中删除和编辑基因的能力，包括与 HIV 感染、抗肿瘤免疫反应和贫血有关的基因。这种方法对他们测试的几乎每一个基因都有效，对几个基因都有强有力的反应。
打开门
研究人员已经开始与其他科学家合作，研究基因疗法。他们还对如何促进 RNA 技术的进步感兴趣---- 比如用于开发 mRNA/2019冠状病毒疾病疫苗的技术---- 其中大小也是一个限制因素。
“这种设计这些系统的能力从 CRISPR 的早期就已经在这个领域里被期望了，我觉得我们已经尽了自己的一份力量朝着这个现实前进,”Lei Stanley Qi 说。“这种工程学方法可以在很大程度上提供帮助。这就是让我兴奋的地方——为新的可能性打开大门。”
Xiaoshu Xu, Augustine Chemparathy, Leiping Zeng, Hannah R. Kempton, Stephen Shang, Muneaki Nakamura, Lei S. Qi. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Molecular Cell, 2021; DOI: 10.1016/j.molcel.2021.08.008
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