谈谈如何分析Realtime PCR的结果 / 四六文摘

一直瞎白话，作为一名知识分子，好歹也得干点儿正经事，既然做科研，就得严谨，就得实事求是。言归正传，写点儿如何分析Realtime PCR结果的体会。为什么想这个呢？我们实验室现在做这个的越来越多，但是看到他们做Presentation时的结果分析的统计图就知道，他们没踏实搞清楚如何去分析结果，就上去糊弄老板了，我曾严肃的当场指出过，但是师姐气得直瞪眼，丫就不明白我是真为她好，我也就懒得跟她纠缠了。但是作为当代，我国，世界级著名学府（校领导自称的），一流专业（就是没什么人报名，一半是调剂的），牛B教授（这个是实话）的不用心学生，我还是忍不住要说一说。

关于Realtime PCR的所有情况的结果如何分析，我不都懂，也不想都懂，但是我需要的关于基因表达差异的2^-^ΔΔCt分析方法，这一点我还是比较清楚的。

原理：

_{^{其实就是这个公式：X_n=X_o × (1+E_x)ⁿ}}

X_n_，表示n个循环后的分子数;

X_o_，表示初始模板分子数;

E_x_，表示分子扩增效率;

n，表示循环数。

首先我们要明白，Realtime PCR的终极目的是要检测其初始模板的量的相对或绝对量（这就是半定量或定量Realtime PCR的区别）。还有一个最为重要的概念就是Ct值，是指目标扩增产物达到所设定的阈值时所经历循环数。

再回到刚才的公式中，我们可以得到下面的式子：

X_t = X_o × (1+E_x)^Ctx = K_x （1）

X_t_，表示到达阈值时的分子数;

K_x，是个常数，因为这是人为设定的。

其他同前式。那么，同理，内参也有一个这样的式子：

R_t = R_o × (1+E_x)^CtR = K_R （2）

把结果均一化，所谓均一化就是通过内参的比较，去除加入模板时的人为差异，即（1）除以（2）得出，

X_t / R_t = X_o / R_o × (1+E_x)^Ct^X ^{- CtR}= K_x / K_R

进一步推出我们关注的初始模板均一化值：

X_o / R_o = K_x / K_R × (1+E_x)^-^（^Ct^{X - CtR}^），

令CtX - CtR =ΔCt，因此，可得

X_o / R_o = K_x / K_R × (1+E_x)^Δ^Ct （3）

至此，我们得到了组内的模板的均一化相对或绝对值，下一步是组间的差异比较。

所谓组间差异比较，在实验中往往就是实验组与正常组，或者是两种或多种处理方法之间的差异比较，因此我们就要将正常组或者其中一个处理组称为参照（Calibrator，cb），同样的这个参照组也会得到一个上述（3）的式子：

X_cbo / R_cbo = K_cbx / K_cbR × (1+E_cbx)^Δ^Ct^cb （4）

再次均一化处理，目的是得到两组之间的差异，当然若是实验中有多组，亦可以多组依次与cb组比较，所得结果可直接观察到组间差异。

也就是：（3）除以（4），得

X / Xcb = (1+E)^-(^Δ^Ct^-^Δ^Ct^cb⁾

再令 -(Δ_Ct -ΔC_t_cb) = -ΔΔC_t（5）

对于一个小于150bp的扩增片段，扩增效率E近似等于1，所以，最终我们得到的均一化后的初始模板量 = 2^ΔΔ^Ct

至此，我们了解了-ΔΔCt是怎么来的。下面是具体拿到结果如何分析。

应用

我们做完Realtime PCR后得到的结果往往是一个EXCEL文档，里面是每组的C_t值。拿到Ct值后，我们按照下面步骤来：

（1）按实验组，Calibrator组，组内参把Ct值分类。

（2）套公式，2^-^ΔΔ^Ct = 2^-(^Δ^Ct ^-^Δ^Ct^cb⁾ 就可计算出每个实验组对

Calibrator组的相对值。

（3）做统计图，将Calibrator组设为1，分别绘制其余各组的图。

以自己的实验为例，进行说明：

（1）首先，拿到数据后，分类，套公式计算：

Ct值 ΔCt 2^ΔΔ^Ct 复孔 1 复孔 2

v	HBs	20.95	-9.85	1.0000	15.57	-12.35	1.0000	24.36	-9.83	1.0000
	actin	30.8			27.92			34.19
	HBe	21.53	-7.23	1.0000	18.54	-8.84	1.0000	24.89	-10.45	1.0000
	actin	28.76			27.38			35.34
o	HBs	20.59	-8.76	0.4698	20.23	-10.58	0.2932	20.01	-8.52	0.4033
	actin	29.35			30.81			28.53
	HBe	20.88	-6.67	0.6783	22.84	-7.12	0.3035	19.63	-9.12	0.3978
	actin	27.55			29.96			28.75
x	HBs	23.57	-3.23	0.0102	22.31	-3.59	0.0023	23.81	-4.46	0.0242
	actin	26.8			25.9			28.27
	HBe	24.64	-3.25	0.0634	22.84	-4.43	0.0470	25.04	-3.76	0.0097
	actin	27.89			27.27			28.8
e	HBs	22.83	-3.41	0.0115	23.12	-2.46	0.0011	22.41	-4.55	0.0257
	actin	26.24			25.58			26.96
	HBe	24.14	-3.18	0.0604	21.93	-3.43	0.0235	25.13	-2.81	0.0050
	actin	27.32			25.36			27.94

（2）然后，整理如下：

	HBs			HBe
V	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000

O	0.4698	0.2932	0.4033	0.6783	0.3035	0.3978

X	0.0102	0.0023	0.0242	0.0390	0.0470	0.0097

E	0.0115	0.0011	0.0257	0.0372	0.0235	0.0050

（4）最后，求平均值做统计图。

最后声明，以上内容是本人辛苦学习，查阅资料后总结出的心得，一方面为自己留个笔记，一方面让懒得去总结的朋友省点儿事儿，如果您看明白了，我想可以一起交流，要是您没看懂，或者压根儿就懒得看，那您也别随便瞎说。但是无论您是哪一种，请别不负责任的随便转帖，当然真牛B的人也不屑转我这破烂儿。

谈谈如何分析Realtime PCR的结果

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