基因敲除小鼠模型构建技术原理

传统策略是通过同源重组的方式，用 Neo 基因替换或删除关键外显子来敲除基因，其周期长，费用高。TALEN，CRISPR 技术出现后，加速了基因敲除鼠的制作，而且降低了费用。CRISPR 切割 DNA 后，会引起的非同源末端修复（NHEJ），这种修复有一定的随机性，如果插入或删除非 3 的整数倍的核苷酸，会发生移码突变，造成基因敲除。移码突变的策略只需要单个 gRNA，但是后期检测一般需要测序，或者用分辨率更高的 Page 胶电泳，检测相对复杂，成本较高。

基因敲除小鼠制备示意图

这里有个需要注意的雷是某些敲除虽然发生了移码，但是蛋白水平检测发现，未能敲除目的基因。目前采用双 gRNA 策略，删除关键外显子或整个目的基因，确保有效敲除目的基因，由于删除了一个大的片段，PCR 检测时，敲除小鼠很容易与野生型区别。