自己做了单细胞测序现在发6分还得补这么多实验？
Mechanism- and Immune Landscape-Based Ranking of Therapeutic Responsiveness of 22 Major Human Cancers to Next Generation Anti-CTLA-4 Antibodies22类人类癌症中基于机制和免疫景观的二代抗CTLA-4抗体治疗反应排序
一、研究背景
CTLA-4是第一个靶向癌症治疗的免疫检查点，也是批准抗CTLA-4抗体，Ipilimumab后，FDA确认的第一个靶点。然而与抗PD-1抗体相比，抗CTLA-4抗体的临床有效率更低，免疫不良反应(irAE)更强。因此，CTLA-4靶向的癌症免疫治疗停滞不前。相比于阻断CTLA-4和同源靶点CD80，CD86的反应，抗CTLA-4抗体通过选择性减少肿瘤微环境的调节性T细胞(Treg)来达到疗效。因此，研究者发明了免疫不良反应降低、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性/吞噬作用(ADCC/ADCP)增强的新一代抗CTLA-4抗体。
二、分析流程
三、结果解读
1.选择性荷瘤小鼠通过pH敏感的抗CTLA-4抗体选择性减少瘤内Treg
以往研究表明，包括Ipilimumab在内的抗CTLA-4抗体选择性减少小鼠肿瘤微环境中的Treg，而不减少脾脏中的Treg。而当使用增强ADCC的抗体时，一些表达CTLA-4的效应T细胞是否被抗CTLA-4抗体减少尚不清楚。作者发现，pH敏感的抗CTLA-4抗体在ADCC和肿瘤排斥中更有效。从而引出了增强ADCC活性是否会损害抗体选择性的问题。
作者首先用流式分析比较了小鼠T细胞亚群表面的CTLA4水平，发现在肿瘤浸润的CD4 T细胞中，基本上所有Foxp3+细胞都表达高水平的细胞表面CTLA-4（图1a）。虽然大部分Foxp3-CD4 T细胞表面CTLA-4呈阴性，但仍可识别到表达CTLA-4的细胞，因而成为抗CTLA-4抗体的潜在靶点（图1b）。而脾脏Treg表面表达很低水平的CTLA-4，非Treg的CD4T细胞表明不表达CTLA-4。（图1c,d）
为了检测抗CTLA-4抗体的选择性，作者分别用pH敏感的HL32和pH不敏感的Ipilimumab处理荷瘤小鼠。24h内即观察到HL32处理的小鼠Treg显著减少，与先前报道一致。为了进一步确定选择性，作者基于图1b将肿瘤浸润CD4和CD8T细胞分成4个亚群（CD4+CTLA4+Foxp3+，CD4+CTLA4−Foxp3+，CD4+CTLA4+Foxp3−和CD8+CTLA4+Foxp3−），并比较它们对HL-32和Ipilimumab的反应性。结果表明，HL32仅减少CD4+CTLA4+Foxp3+亚群。值得注意的是，CD4+CTLA4+Foxp3-细胞没有减少，即使其中一部分细胞表达CTLA-4（图1c）。而Ipilimumab在24h内不减少任何亚群。抗体处理96h后，Ipilimumab和HL32处理小鼠中均观察到肿瘤浸润Treg的减少。同样，减少仅限于CD4+CTLA4+Foxp3+亚群。且在脾脏T细胞的任何亚群都观察不到减少（图1de）。
上述结果共同表明，肿瘤浸润CD4+CTLA4+Foxp3+细胞的选择性减少与高水平表达的细胞表面CTLA-4相关。
图1.抗CTLA-4抗体减少肿瘤微环境的Treg的选择性
2.人类肿瘤对抗CTLA-4免疫治疗反应性的排序方法
第一步：挖掘CTLA-4反应数据，鉴别与抗CTLA-4抗体Ipilimumab临床反应性相关的4个特征。并将ADCC作为第5个特征，用于新一代ADCC依赖的抗CTLA-4抗体的治疗反应性排序。
第二步：分析22类肿瘤中7279个独立样本的TCGA RNAseq和DNAseq数据，分析构成上述5个特征的成分。基于这些成分的中位值排序，每个特征的排序是由1-3个成分的平均排序得来。最后，作者对这5种特征进行同等的加权处理，得到22种癌症的综合排序。
3.特征1：基于CTLA4表达的人类癌症排序
作者首先挖掘了抗CTLA-4治疗反应数据库，识别与应答显著相关的基因。比较基因的转录水平，发现169个基因显著上调，178个基因下调。且通路分析表明上调基因与免疫应答显著相关，下调基因与免疫应答不相关。在上调基因中，CTLA-4转录水平在Ipilimumab应答样本中显著升高。相比之下，CTLA-4的配体CD80和CD86与应答与否无显著关联。（图2b）
上述数据共同表明，Treg选择性减少的一个关键因素是CTLA-4的表达水平。因此，作者将样本的CTLA4表达水平作为预测免疫治疗反应性的一个关键因子。利用癌症样本的RNAseq数据，得到CTLA4表达值的排序（见表1）。大部分癌症中CTLA4转录水平高。其中，非小细胞肺腺癌(LUAD)水平最高，其次是黑素瘤转移灶、基底型乳腺癌和头颈部鳞状细胞癌(HNSC)。低级别脑胶质瘤(LGG)CTLA4表达水平最低。
图2.CTLA-4转录与Ipilimumab治疗反应性有关
4.特性2：肿瘤组织抗CTLA-4抗体ADCC潜能的排序
据报道，抗CTLA-4治疗与等位基因FCGR3A158F有关，因为该等位基因编码一种增强IgG Fc结合的蛋白，从而提高ADCC/ADCP活性。挖掘数据库中的158F等位基因频率发现，大多数癌症类型具有相似的158F等位基因频率。（图3a）肿瘤中FCGR3A高表达要么是因为表达FCGR3A的细胞丰富，要么是因为单个细胞中表达水平较高，而两者均与ADCC/ADCP活性相关。因此作者又评估了FCGR3A的转录水平（图3b）。
CTLA-4靶向治疗会减少肿瘤特异性Treg，新一代抗CTLA-4疗法的效应该更明显，可能显著消耗Treg。因此作者使用CIBERSORT估计了肿瘤浸润Treg的含量，发现大多数癌症类型中Treg含量较高（图3c）。
由于上述3个属性对ADCC的相对重要性不明确，所以作者对FCGR3A158V等位基因频率、FCGR3A表达和Treg含量进行加权处理，生成ADCC评分（表1）。结果表明，膀胱癌(BLCA)ADCC排名最高，STAD ADCC排名最低。
图3.挖掘TCGA数据库中22类癌症ADCC特征的基因组和RNAseq数据
5.特性3：抗CTLA-4治疗反应性的转录组特征
为了确定临床反应的转录组特征，作者使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)将癌症转录组数据中的免疫特征评分与6个免疫基因集进行比较。（图4a）结果表明，在应答抗CTLA-4抗体的预处理样本中，三种免疫特征（“适应性免疫应答的正向调节”、“淋巴细胞激活”和“效应性CD8 T细胞标志物”）显著上调。作者比较了22类癌症中的这3个特征并排序（表1）。其中，适应性T细胞应答中特征信号最强的是LUAD、HNSC和肾透明细胞癌(KIRC)，而GBM和LGG信号最低（图4b）。
图4.用CTLA-4反应数据的免疫特征基因评分排序
6.特性4：基于免疫浸润细胞比例的排序
为了研究某些特定的白细胞亚群是否会影响抗CTLA-4治疗应答率，作者用CIBERSORT算法评估了肿瘤微环境中每个白细胞亚群的比例。其中，CD8 T细胞，巨噬细胞M1与抗CTLA-4反应正相关；静息CD4记忆T细胞与之负相关（图5）。其他细胞类型，包括活化CD4记忆细胞、巨噬细胞M0和M2与Ipilimumab单抗的反应无显著相关。于是作者根据CD8 T细胞、巨噬细胞M1、静息CD4记忆T细胞的含量对22种癌症类型进行排序（图5b）。加权排序见表1。结果表明，转移性(SKCM-TM)和原发性(SKCM-TP)黑素瘤对Ipilimumab反应最好，而肾脏肾乳头状细胞癌(KIRP)的反应最差。
图5.不同癌症类型中免疫细胞比例评估
7.特性5：肿瘤突变负荷和新抗原计数
肿瘤突变负荷会影响Ipilimumab的治疗反应。一致的是，抗CTLA-4应答样本的非沉默突变率和新抗原负荷显著高于不应答样本，而突变率的增加又导致潜在新肿瘤抗原池的扩大，与Ipilimumab的反应相关。因此，作者根据突变负荷和新抗原对22种癌症类型进行了排序。其中SKCM-TM、LUAD和LUSC排在前3位。
8.癌症反应性排序的一个综合指标
分析了抗CTLA-4治疗反应性的5个特性后，作者就能够根据个体属性对22种主要人类癌症进行排序（表1）。对每个属性进行加权处理后，可以生成一个癌症反应性的综合指数。
综合分析，SKCM-TP、LUAD、HNSC和LUSC是抗CTLA -4治疗反应最强的4类癌症。而它们对mAb反应强是不同原因所致：SKCM-TM、LUSC和LUAD突变/新抗原负荷排名较高；SKCM-TM、LUAD和HNSC的CTLA4表达水平较高；SKCM-TM在免疫细胞浸润模式排第一；LUAD和HNSC在基因特征排名较高。强调了结合不同属性对抗CTLA-4 mAb潜在反应性排序的重要性。
表1.不同癌症类型对抗CTLA4治疗反应性的排序
9.在人类肺癌组织中预测Treg删除的选择性
作者根据上述分析预测到NSCLC、LUAD、LUSC对新一代抗体反应很好，于是接下来作者选取NSCLC组织进一步深入分析了人类肿瘤浸润T细胞，以预测抗CTLA-4抗体诱导Treg减少的选择性。
首先，作者分析了NSCLC的scRNAseq数据集，绘制了CTLA4在16个T细胞亚群中的表达情况。结果表明，CTLA4转录产物主要集中在其中4个亚群：CD4 T细胞的C9、C8、C7和CD8 T细胞的C6（图6ab）。接下来，作者用小提琴图展示了这4个亚群中单个细胞的CTLA-4表达水平（图6c），其中活化Treg CD4-C9的CTLA-4表达水平最高，最可能成为抗CTLA-4抗体的靶点。而耗竭CD4 T细胞CD4-C7不表达FOXP3，CTLA-4水平较低但仍显著。另外两个亚群CTLA-4表达水平远低于CD4-C9，不太可能对抗体易感。
根据图1的荷瘤小鼠模型的结果，FOXP3-CD4细胞尽管显著表达CTLA-4，但其不受CTLA-4抗体的影响而减少。外推到人类癌症，抗CTLA-4抗体的选择性减少作用可能仅限于活化的Treg。已有研究表明癌症中活化的Treg表达CCR8标记，于是作者进一步分析CTLA-4+细胞表面CCR8标记，发现绝大多数CTLA-4+细胞表达CCR8（图6hi）。作者分析先前的数据也发现肺癌组织中CCR8选择性表达于活化的Treg上，而活化Treg CD4-CD9在四个亚群中CTLA-4表达水平最高。因此，增强ADCC的抗CTLA-4抗体很可能是选择性减少NSCLC中活化的Treg。
图6.人NSCLC中预测抗CTLA-4 mAb介导的Treg减少的选择性
小结
本篇文章中，作者首先基于荷瘤小鼠细胞表面CTLA-4表达和表面分子标志将T细胞分为不同亚群，然后用pH敏感和pH不敏感的抗CTLA-4抗体处理荷瘤小鼠，分析发现新一代抗体选择性减少高表达CTLA-4的细胞。
然后作者分析了TCGA数据库中22个癌症类型，7279个独立肿瘤样本的RNAseq和基因组数据，从转录特征、免疫特征、免疫细胞浸润等方面鉴定出抗CTLA-4应答的5个特征，每个特征又包含1-3个组分，加权处理后获得一个综合的治疗反应性排序。分析预测表明，转移性黑素瘤应答性最好，非小细胞肺癌(NSCLC)对抗CTLA-4抗体高度应答。于是作者进一步通过分析人类NSCLC浸润T细胞的流式细胞术和单细胞RNAseq分析结果，发现增强ADCC的抗CTLA-4抗体对活化的Treg具有高度选择性。