BD 556547 凋亡试剂盒使用方法

一、概述  在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒的组份：

556547a  Annexin V Binding Buffer, 10X conc (51-66121E）

556547b  Annexin V-FITC (51-65874X)

556547c  Propidium Iodide Staining Solution(51-66211E)

三、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒的操作步骤 ：

贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。注意过度消化可损伤细胞。在消化时可加2％的BSA可防止消化过度。如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须清除EDTA：在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。 （1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；

（2）细胞收集。悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合），于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞）

（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞； （4）加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；

（5）Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟； （6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。

（7）上机前，补加200μL的1×Binding Buffer。

四、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒的保存： 4℃保存，两个月内可保持稳定；避免反复冻融。

五、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒的注意事项：（1）本试剂只适用于实验，不适用于临床检测。（2）PI（propidium iodide，碘化丙锭）有毒性，能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用，使用时需戴手套。（3）Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察。（4）整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作，以免影响细胞状态。（5）在细胞洗涤的后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。（6）为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。（7）PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，短可在上机前5分钟再加入PI染色。

英文版说明书方法部分翻译：

试剂：1.FITC Annexin V(成分编号51-65874X)：每次测试使用5μl。

2.碘化丙啶(PI)(组份编号51-66211E)是一种方便、即用的核酸染料。每次测试使用5μl。

3.10X Annexin V结合缓冲液(组分号51-66121E)：0.1M Hepes/NaOH(pH 7.4)，1.4M NaCl，25 mM CaCl2。

染色：对于1X工作液，将10X Annexin V结合缓冲液的1份稀释到9份蒸馏水中。

1.用冷PBS洗涤细胞2次，然后以1×10^ 6个/ml浓度用1✖️ 结合缓冲液悬浮细胞.

2.将100μl（1×10^5个细胞）的溶液转移到5ml的培养管中。

3.加入5μl的FITC Annexin V和5μl PI。

4.轻轻旋转细胞，在黑暗中常温(25°C)孵育15分钟。

5.每管加入400μl的1X结合缓冲液。 1小时内进行流式细胞仪分析。

设置流式对照 

以下对照用于设置补偿和象限：1.未染色细胞。 2.FITC Annexin V(无PI)染色细胞。 3.PI染色(不含FITC Annexin V)。

其他染色对照：用FITC Annexin V和/或FITC Annexin V和PI对易诱导凋亡的细胞系进行阳性对照染色。值得注意的是，凋亡和坏死的基础水平在人群中差异很大。因此，即使在没有诱导凋亡的情况下，大多数细胞群体也会包含一小部分细胞呈凋亡阳性(FITC Annexin V阳性，PI阴性或FITC Annexin V阳性，PI阳性)。未处理的群体被用来定义凋亡和死亡细胞的基础水平。然后，通过从处理组中的凋亡细胞百分比中减去未处理组中的凋亡细胞百分比来确定已被诱导进行凋亡的细胞的百分比。由于细胞死亡是细胞凋亡的最终结果，处于凋亡晚期的细胞会有受损的细胞膜，PI和FITC Annexin V染色呈阳性。因此，该检测不能区分已经经历过凋亡细胞死亡的细胞和那些死于坏死途径的细胞，因为在任何一种情况下，死亡的细胞都会同时染色FITC Annexin V和PI。