柴胡疏肝散治疗卒中后抑郁的网络药理学研究

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是脑卒中常见的并发症之一^[1]，研究发现，PSD的发生率在2周内和3个月分别为25.4%和24.1%^[2-3]。课题组前期临床研究及动物实验均证实，柴胡疏肝散在PSD的治疗中显示良好的疗效^[5-6]。然而，由于中药复方多成分、多靶点的调节作用，使得柴胡疏肝散治疗PSD的作用机制并不明确。

网络药理学是建立在疾病-基因-药物多层次网络基础上，从整体上预测药物靶点、提高药物发现效率的新兴学科^[7]。目前网络药理学已经应用于多种复方中药的研究，Li等^[8]通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）发现补肺益肾方中216利用TCMSP数据库，通过网络药理学研究酸枣仁治疗失眠的体内效应成分。以上研究表明，采用TCMSP数据库挖掘中药的活性成分及其作用靶点，从而研究药物的作用机制具有可行性。本研究通过网络药理学技术探讨柴胡舒肝散在分子水平多成分、多靶点对PSD的整体调节作用，为柴胡疏肝散的实验研究及临床合理应用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  研究对象

TCMSP^[10]是整合药物代谢动力学、药物化学和药物-靶点蛋白网络-疾病网络的平台。本研究依托

1.2  研究工具

TCMSP（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/index.php）；UniProt（http://www.uniprot.org/）数据库获取中TTD/ TTD.asp）和PharmGkb（https://geneticassociationdb. nih.gov/）数据库获取卒中和抑郁的靶蛋白；Cytoscape 3.2.1软件（http://www.cytoscape.org/）构建化合物-靶点相互作用网络。

1.3  柴胡疏肝散活性化合物的筛选

中药饮片须通过吸收、分布、代谢、排泄利用TCMSP数据平台，对柴胡疏肝散每一活性分子的OB、DL、BBB、HL进行评估，选取同时满足OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥−0.3和HL≥4 h的化学成分作为候选活性成分。

1.4  柴胡舒肝散治疗PSD作用靶点筛选

利用GADCC、TTD和PharmGkb数据库对卒中和抑郁的编码基因进行查找，并确定二者共有的靶点作为疾病靶点。基于分子对接技术，对柴胡疏肝散有效成分和疾病靶点联合筛选，得到柴胡疏肝散治疗PSD的作用靶点。

1.5  靶点的生物过程分析和代谢通路分析

生物学信息注释数据库（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/）能够提供系统综合的生物功能注释信息，找出最显著富集的生物学注释^[13]。将筛选后得到的柴胡疏肝散抗PSD作用靶点导入DAVID数据库，通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，并将所有靶基因名称校正为其官方名称（official gene symbol），经检索和转化操作，进行GO（gene ontology）生物学过程富集分析和KEGG（KEGG pathway analysis）代谢通路富集分析^[14]。

2  结果

2.1  柴胡疏肝散中活性化合物筛选

对柴胡疏肝散成分筛选后发现，共有121个活性分子，分别是白芍5个、香附8个、陈皮11个、甘草69个、枳壳12个、川芎8个和柴胡8个。通过UniProt数据库将上述成分的靶点转化为基因名，构建中药成分-靶点图（图1）。筛选出其中度（degree）＞40的活性成分（表1），其中柴胡中5个（乙酸亚油醇酯、豆甾醇、茵陈黄酮、α菠甾醇、柴胡皂苷A）、川芎中4个（杨梅酮、川芎哚、Z-藁本内酯、[5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one、橘霉素、川皮苷、对香豆酸、异橙皮苷、桔皮素]、香附中9个（谷甾醇、异黄檀素、凯林醇、玫瑰菌素、Khell、hyndarin、stigmasterol glucoside qt、sugeonyl acetate、豆甾醇）和白芍中4个（芍药内酯苷、β-谷固醇、谷甾醇、芍药苷）。

2.2  与PSD相关的药物作用靶点

利用GADCC、TTD和PharmGkb数据库对卒中和抑郁的编码基因进行查找，卒中涉及的靶点787个，抑郁相关靶点175个，确定二者共有的41个靶点作为疾病靶点（表2）。基于分子对接技术，对柴胡疏肝散121个有效成分和41个疾病靶点联合筛选，得到5个对接良好^[15]的靶蛋白作为柴胡疏肝散治疗PSD的作用靶点（表3），分别为雌激素受体（ESR1）、前列素内环氧化物合成酶2（PTGS2）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、SLC6A4和白三烯A4水解酶（LTA4H）。

2.3  靶点的生物功能分析

结果显示这5个预测靶点与雌激素应答、炎症应答、调节突触合成、记忆过程、生物合成过程、药物反应和昼夜节律等生物学过程有关（表4）。反映了PSD发病涉及体内多个生物过程的异常，柴胡疏肝散可能通过改善这些生物过程进而发挥抗PSD作用。

2.4  靶点的代谢通路分析

柴胡疏肝散抗PSD作用靶点的KEGG代谢通

3  讨论

柴胡疏肝散来源于明·张景岳所著《景岳全书》，由柴胡、香附、川芎、芍药、枳壳、陈皮和甘草共同组成，其作为疏肝理气的经典方，近年来在PSD治疗中的作用也逐渐引起了关注。柴胡疏肝散不仅能改善抑郁症状，而且能促进神经功能恢复^[6,16]，这与本课题组前期研究结果相符合。现代药理学研究也证实其多种单体成分具有抗抑郁和神经保护作用^[17-19]。

GO生物学过程富集分析结果提示，柴胡疏肝散的靶基因涉及雌激素应答、调节突触合成、炎症应答、记忆过程等多个生物过程。这些生物过程与神经系统的功能密切相关，可能参与了抑郁的病理生理过程。雌激素通过调节细胞骨架、蛋白转运甚至快速蛋白合成，进而改善突触传递功能^[20-21]，并参与学习、记忆等多种行为过程^[22]。突触功能异常表达涉及脑卒中的各个阶段^[23-25]，芍药苷可以通过上调5-羟色胺受体的表达，增强突触可塑性、抑制兴奋性毒性，发挥神经保护作用^[19,26]。同时抑郁与相关情感脑区突触可塑性破坏有关^[27]，中药复方可以逆转N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体NR1亚基的表达所致的突触异常，改善抑郁行为^[28]。研究证实炎症反应同PSD的发生发展密切相关^[20]，小胶质细胞作为介导神经炎症的主要细胞，在脑缺血后极化为M1型，分泌大量的促炎症因子^[22]，加重脑损伤，并导致抑郁的发生^[29-30]。芍药苷能抑制核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，对抗趋化性β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导的小胶质细胞活化和炎症^[31]；柴胡根乙醇提取物和柴胡皂苷可以减轻脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞炎症^[32]。结合本实验中的GO富集分析，推测调节炎症反应可能是柴胡疏肝散的作用机制之一。

KEGG代谢通路分析结果显示，柴胡疏肝散活性成分相关靶点ESR1、PTGS2、GSK3B、SLC6A4和LTA4H参与了花生四烯酸代谢、催乳素信号通路、5-羟色胺能突触和甲状腺激素信号通路。其中花生四烯酸代谢通路主要与炎症反应和氧化应激显著相关^[33]。5-羟色胺能突触通路由5-羟色胺和分布于脑部不同部位的突触前后膜上的各类5-羟色胺受体组成，可以影响γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺等其他神经递质释放，还介导了记忆、学习、行为、情感等大脑高级活动，其功能改变常导致抑郁症、焦虑症和老年性痴呆等疾病发生^[34]。催乳素信号通路通过下游JAK/STAT、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路广泛参与细胞增殖分化、生长发育、代谢和免疫调节^[35]。甲状腺激素信号通路主要参与生长发育过程，本课题组研究证实，甲状腺激素水平减退会导致成人的脑白质损伤^[36]，但机制目前尚不明确。本研究发现，柴胡疏肝散治疗PSD的靶点参与了花生四烯酸代谢通路（2个靶点）、催乳素信号通路（2个靶点）、5-羟色胺能突触通路（2个靶点）和甲状腺激素信号通路（2个靶点），表明柴胡疏肝散中的活性成分可能通过参与上述通路，进而减轻炎症反应、促进神经元细胞的生长发育，从而发挥抗PSD作用。

靶点研究表明，ESR1、PTGS2、GSK3B、SLC6A4和LTA4H可能是柴胡疏肝散治疗PSD的靶基因，ESR1主要影响空间记忆和突触可LTA4H参与动脉粥样硬化形成、发展的多个阶段，在炎症反应、免疫调节过程中发挥作用^[40]。

有证据显示GSK3β参与了小胶质细胞炎症反应的过程。GSK3β作为磷酸化磷酸酶（PTEN）的上游蛋白^[41]，通过PTEN激活下游PI3K/Akt通路，继而促进小胶质细胞M2作用^[42]。本研究发现GSK3β通过信号通路仅参与了昼夜节律基因的表达，与炎症无明显关联。可能与研究方法的局限性相关，网络药理学技术还处于初步阶段，在很多方面还存在局限性和需要解决的问题，但仍为进一步研究柴胡疏肝散治疗脑病提供了药理学研究基础和新的思路。

参考文献（略）

来  源：盛  蕾，刘元月，胡  丹，范琪琪，朱亦诚，张晓浩，凌志香，江雪梅，丁彩霞，肖  婧，汤银燕，李传游，张兰坤，李婷婷，朱羽佳，陆  茵. 柴胡疏肝散治疗卒中后抑郁的网络药理学研究 [J]. 中草药, 2018, 49(15):3509-3515.