桂圆壳总黄酮的超声波提取工艺优化及 其抑菌效果的研究

熊俐，周健，曹新志，邹永建 (I匹l；II理工学院食品与生物技术应用研究所，I匹l JII自贡643000)

摘要：本文研究以桂圆壳为原料，利用超声波乙醇浸提法提取总黄酮，优化提取工艺，并研究黄酮的抑茵作用。研 究发现乙醇浓度对黄酮得率的影响最大，最佳的提取工艺参数是：乙醇浓度为70％，料液比为1：25，超声次数为2次， 超声时间为30 min，此时黄酮得率为6．11％。提取物对细菌的抑制力>对酵母茵的抑制力>对霉菌抑制力。 

关键词：桂圆壳；黄酮；超声波；提取工艺；抑茼作用 

黄酮类化合物是具有多种生物活性的多酚类化 合物，具有抗菌、消炎、抗突变和降压等作用，在抗氧 化、抗癌、抑制脂肪酶等方面也有显著效果“q。黄酮 类化合物广泛分布于植物界中，是极具有开发前景 的天然抗氧化剂，人们对植物黄酮的提取工艺和生 物活性展开了广泛的研究删。桂圆学名龙眼(Dimocarpus longan lour．)，为无患子科龙眼属常绿果树，据 报道桂圆壳中含有大量的生物碱及其他中药成分[21。 我国的桂圆产量居世界首位，果实在加工过程中，大 量的壳被作为废料丢弃，造成资源的极大浪费。 近年来超声技术应用于提取植物生物碱、苷类 等生物活性物质的研究已有报道，表明它具有能耗 低、效率高、不破坏有效成分的特点，可加速有效成 分进入溶剂，增加其提取率[5-61。本研究以桂圆壳为 原料，利用超声波乙醇浸提法提取总黄酮，优化提取 工艺，并研究黄酮的抑菌作用。

 1材料与方法 

1．1试验材料 收稿日期：2011-03-07 基金项目：四川省教育厅科研项目(09ZB040)；四川理工学院2011-2012年大学生创新基金。 作者简介：熊俐(1976-)，女，IⅡl J Jl自贡人，实验师，硕士，研究方向：食品科学，联系方式：[e-mail]。 万方数据 第47寒(昆第164研) 熊俐等：桂圆壳总黄酮的超声波提取工艺优化及其抑菌效果的研究 31 

1．1．1原料 干桂圆(在泸州市百子图蔬菜批发市场购买)。 

1．1．2抑菌活性指示菌 埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillus niger)，由四川理工学院生物工程学院实验中心分离 保存。 

1．1．3仪器 KQ一500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪 器有限公司)，752紫外可见分光光度计(上海精密 科学仪器公司)，ZF—I三用紫外分析仪(上海顾春电 光仪器厂)，SHZ—D循环水式多用真空泵(河南巩义 英峪豫华仪器)等。 

1．1．4试剂 芦丁标准品丁(AR，天津一方科技有限公司)， 乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铝、盐酸 (均为AR，成都科龙试剂厂)。 

1．1．5培养基 IJB培养基：109胰蛋白胨，59酵母粉，109 NaCl， 完全溶解后，加水定容至lL，调pH值至7．0—7．4。用 于大肠杆菌的培养。 YPDA培养基：209蛋白胨，109酵母抽提物，29 葡萄糖，15mL0．2％腺瞟呤溶液，加水定容到lL。 1200C高压灭菌15rain，室温贮存。用于酿酒酵母的培 养。 改良马丁培养基：59蛋白胨，19磷酸氢二钾，29 酵母浸出粉，0．59硫酸镁，20．09葡萄糖，加水定容至 1L，调节PH值约为6．8。用于霉菌的培养。 

1．2试验方法

 1．2．1总黄酮成分提取工艺流程： 龙眼壳一烘干_+粉碎．+称重_超声波辅助乙醇 浸提-+过滤 桂圆壳烘干，粉碎，取龙眼壳粉末59，加入一定 浓度的乙醇，在70℃下超声波(功率：200W)提取一 定时间，抽滤。滤渣再提取一次，合并两次滤液，减压 回收乙醇至滤液仅剩10 mL左右为止，转移至100 mL容量瓶中，用60％乙醇稀释至刻度，得样品液。 

1．2．2总黄酮的测定 A1(N03)3比色法：以A1(N03)3为显色剂，在碱 性条件下利用其与黄酮形成红色螯合物的特征，以 芦丁为对照品，在510nm处测定其吸收度，从而得 到待测物质的黄酮含量。

1．2．2．1标准曲线的制定 (1)对照品试液的配制：称量烘干至恒重的芦丁 对照品100．4mg，用适量30％乙醇加热溶解，冷却， 转移至100mL容量瓶中，用30％乙醇定容至刻度。 从中取10mL溶液置于100mL容量瓶，用30％乙醇 定容至刻度，即对照品储备试液，其芦丁浓度为 0．1004 mg／mL。 (2)标准曲线的绘制：各取对照品试液0．0mL、 0．5mL、1．0mL、2．OmL、3．OmL、4．OmL和5．0mL，分别置 于10mL容量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液0．5mL，混 匀，放置6min。加10％硝酸铝溶液0．5mL，摇匀，放置 6rain。加5％氢氧化钠溶液4mL，用30％乙醇定容至 刻度，静置15min，测试510nm下的吸光度值。

 1．2．2．2样品中总黄酮含量的检测 吸取样品液0．50mL，置于10．00mL容量瓶，按 标准曲线的制备方法测定其吸光值，根据回归方程 计算样品中总黄酮的含量。桂圆壳中总黄酮提取率 的计算公式： 提取率％=堂黄哞善謇耋燃×100 

1．2．3总黄酮的抑菌试验 取提取物进行抑菌试验，采用滤纸片法网，将大 肠杆菌于36℃培养24h，酿酒酵母和黑曲霉于28℃ 培养72h，测量其抑菌圈的直径。 

1．2．4实验设计 设计单因素试验和L9(43)正交试验，研究乙醇浓 度、料液比、提取时间和提取次数对总黄酮得率的影 响。

2结果与分析 

2．1标准曲线 应用最小二乘法将芦丁标准液浓度与吸光度值 做一元线性回归分析，由Microsoft Excel获得回归 曲线：Y=1．0479X+0．0012(R2=0．9999)。 2．2提取工艺研究 

2．2．1单因素实验 (1)乙醇浓度对黄酮得率的影响 在料液比为1：20、超声时间为20min，超声次数 为2次的条件下，研究不同浓度的乙醇(40％、50％、 60％、70％、80％和90％)对黄酮得率的影响。研究发 现(图1)：随着乙醇浓度的上升，黄酮得率先是逐渐 上升，乙醇浓度为70％时黄酮得率达到最高值 (5．83％)，之后逐渐降低，因此确定乙醇的适宜浓度 为70％。黄酮得率的这一变化规律很可能是因为极 性较大的乙醇易将黄酮类物质提取出来，但当乙醇 万方数据 食品与发醇,r．-1-技 加11年第4期 浓度过高(>70％)时，会导致提取液中的杂质增加， 而杂质对黄酮可能有吸附作用，导致其得率降低。 (2)料液比对黄酮得率的影响 在乙醇浓度为70％、超声时间为20min，超声提 取次数为2次的条件下，研究不同浓度的料液比(1： 10、1：15、1：20、1：25、1：30和1：35)对黄酮得率的影 响。研究发现(图2)：随着料液比的增加，黄酮得率 先是逐渐逐渐上升，料液比为1：25时黄酮得率达到 最高值(5．71％)，之后随着料液比的继续增加黄酮得 率基本无变化，因此确定适宜的料液比为1：25。 零 辫 难 旺 掘 40 50 60 70 80 90 乙醇浓度／％ 图1乙醇浓度对黄酮得率的影响 Fig．1 Effect of the concentration of ethanol on extracting efficiency of flavonoids 1：10 1：15 1：20 1：25 1：30 1：35 料液比 图2料液比对贡酮得翠的影响 Fig．2 The effect of solid-liquid ratio OR extracting efficiency of flavonoids (3)超声时间对黄酮得率的影响 在乙醇浓度为70％、料液比为1：25、提取次数为 2次的条件下，研究不同超声时间(15min、20min、 25min、30 min、35 min和40min)对黄酮得率的影响。 研究发现(图3)：随着超声时间的增加，黄酮得率先 是逐渐逐渐上升，25rain一35 min时，黄酮得率趋于稳 定，之后得率略有下降，因此确定适宜的提取时间为 25min。超声时间过长(>35min)时，黄酮得率下降的 原因可能与部分黄酮被氧化有关。 (4)超声次数 在乙醇浓度为70％、料液比为1：25、提取时间为 25rain的条件下，研究不同超声次数(1、2、3和4次) 对黄酮得率的影响。研究发现(图4)：超声提取2次 时，黄酮得率较高，之后随着超声提取次数的增加黄 酮得率基本不变，因此确定适宜的提取次数为2次。 7 6 述5 褂4 警3 极2 1 O 15 20 25 30 35 40 提取时间，min 图3超声时间对黄酮得率的影响 Fig．3 Effect of ultrasonic time on extracting efficiency of flavonoids 龄 褂 贮 旺 般 1 2 3 4 提取次数 图4超声次数对黄酮得率的影响 Fig．4酣ecl of ultrasonic times on extracting efficiency of flavonoids 

2．2．2正交试验 在单因素实验结果的基础上，设计b(43)正交试 验(表1)，研究乙醇浓度、料液比、超声时间和超声 次数对黄酮得率的影响，优化超声波乙醇浸提法工 艺。 表1正交试验因素水平 Tab．1 The table of factors and level 正交试验结果见表2。由极差分析得出RA> RB>RC>RD，表明各因素对黄酮得率影响的主次顺 序为：乙醇浓度>料液比>超声时间>超声次数，其中 乙醇浓度对其影响最大。最佳的发酵工艺参数为为 A：B2C3D2，即乙醇浓度为70％，料液比为1：25，超声时 间为30rain，超声次数为2次。设计三个平行实验， 对最佳发酵工艺进行验证，发现黄酮得率为6．11％， 说明该工艺提取率较高且稳定，合理可行的。 7 6 5 4 3 2 1 O 零＼瓣畲}旺掘 万方数据 苇47卷(是第164瑚) 熊俐等：桂圆壳总黄酮的超声波提取工艺优化及其抑菌效果的研究 33 

2．3抑菌实验 用最佳工艺条件下制得的桂圆壳提取物来进行 抑菌实验，发现对细菌的抑菌圈为18．5ram，对酿酒 酵母菌的抑菌圈为13．27mm左右，而对霉菌的抑菌 圈为9．3mm，说明该艺条件下制得的桂圆壳提取物 对细菌生长有较强的抑制效果，对酿酒酵母的生长 有一定抑制效果，而对霉菌的抑制作用弱。 

表2正交试验结果 Tab．2 The data of orthogonal experiment 3讨论 黄酮类化合物是具有多种生物活性的多酚类化 合物，广泛分布于植物界中，是极具有开发前景的天 然有机抗氧化剂。本研究以桂圆壳为原料，利用超声 波乙醇浸提法提取总黄酮，优化提取工艺，并研究桂 圆壳总黄酮的抑菌作用。研究发现最佳的提取工艺 参数为A：B2CsD：，即乙醇浓度为70％，料液比为1：25， 超声提取时间为30 min，超声提取次数为2次，此时 黄酮得率为6．1l％，比梁志等用乙醇热回流法从桂 圆壳中提取的黄酮得率高许多[81。研究还发现桂圆壳 提取物对细菌、酿酒酵母菌和霉菌有不同的抑制效 果，抑制力顺序为：对细菌的抑制力>对酵母菌的抑 制力>对霉菌抑制力。本研究为桂圆壳总黄酮的开发 利用提了供理论支撑和实践依据。