甘肃省礼县西山遗址出土马骨的DNA 初步研究
摘要：运用古DNA技术对甘肃省礼县西山遗址出土的古代家马样本进行遗传学分析。选取3匹家马骨骼样本，从中提取DNA并对线粒体DNA控制区和毛色控制基因的核DNA进行PCR扩增。全部样本获得了线粒体DNA控制区和毛色控制基因的核DNA序列。在这3个线粒体DNA序列中共检测出3个不同的单倍型，可以归属到2个不同的单倍型类群。毛色控制基因的SNP检测结果显示西山遗址古代家马有栗色（chestnut）和骝色（bay）两种不同毛色。本文的发现为研究秦人牧马提供了新的线索。
西山遗址位于甘肃省礼县县城之西、西汉水北岸的山坡上。由甘肃省文物考古研究所、北京大学考古文博学院、中国国家博物馆考古部、陕西省考古研究所和西北大学文博学院等单位联合组成“早期秦文化调查、发掘与研究”课题组，在2004年西汉水上游考古调查的基础上，于2005年对该遗址进行了考古发掘，除发现有丰富的史前时期文化遗存外，还发现了周时期城址1座，发掘出大量周代灰坑、墓葬、动物坑等遗迹，出土了丰富的遗物包括陶器、青铜器等，其文化特点显示属秦人的文化遗存。
对该遗址出土的动物遗存的研究表明，西山古代居民对动物资源的开发与利用从新石器时代到两周时期不断变化，从中亚或西亚引进的家养马、黄牛、绵羊和山羊更是加快了生业经济与社会文化的发展。本文对该遗址出土的周代马骨遗存进行DNA的提取和遗传特征的初步分析，也对古DNA在该遗址出土动物遗存中的保存状况进行评估。
一、材料与方法
1.样本采集
在动物考古学家对此次西山遗址发掘出土的动物遗存进行鉴定和初步研究的基础上，本文对该遗址出土马骨遗存中保存较好的3例样本进行了采集。这3例马骨所出遗迹单位的年代均为周代，样本的具体信息见表一。
2.实验方法
首先取马骨上约1厘米见方的小块。为了去除外源DNA污染、保证样本本身DNA受到最小的损害，使用钻头打磨骨骼表面及截面，使用有效氯6％的次氯酸钠溶液浸泡和紫外照射（UVP，紫外灯位于样本以上8厘米的高度，波长254nm），之后使用液氮冷冻研磨机将骨骼打磨成粉（SPEX）。在此基础上进行DNA的提取，DNA提取的方法是基于商业化试剂盒QIAquickR PCR Purification Kit的硅柱离心法，该方法最早由Yang等提出。提取到的古DNA选择线粒体DNA控制区（mtDNAD-loop）和毛色控制基因的核DNA片段进行PCR扩增，电泳检测为阳性的PCR产物送到测序公司（Invitrogen），使用Sanger法（双脱氧终止法）直接测序（正反引物双向测序）。PCR产物所得到的序列使用 Chromas Pro 软件进行读取，通过Clustal X2 软件进行序列比对，并使用BioEdit进行编辑。具体的实验步骤详见。
二、结果
1.线粒体 DNA 控制区序列变异情况及单倍型类群归属
西山遗址采集到的3个古代马骨样本全部获得了线粒体DNAD-loop的序列262bp（15493~15754）。将这3个序列与参考序列X79547进行比对，共检测出11个多态性变异位点，全部为转换，没有颠换、插入与缺失，且转换在嘧啶之间的比例略高，占54.5%（6/11）。本文的这3个序列属于3个不同的单倍型，可以归属于单倍型类群B2和D2，实验结果详见表二。
2.毛色控制基因的 SNP 位点检测
依据以前研究，本文亦选择常见的和研究相对较深入的6种毛色控制基因的8个SNP位点进行检测，包括MC1R(g.201)、ASIP(g.2183~2193del)、MATP(g.72)、KIT(g.786)、KIT(g.1120)、SILV(g.1457)、SILV(g.697)、EDNRB(c.323_333)，其野生型为E/E、A/A、C/C、KM0/KM0、sb1/sb1、z/z、z/z、ov/ov。
本文选择的3个古代马骨样本全部获得了SNP变异结果，详见表三。在这3个样本中，其基因型均与野生型不同，但是发生变异的只有基因MC1R(g.201)和ASIP(g.2183~2193del)，分别控制表型栗色（chestnut）和黑色（black），其他基因位点未发生变异。
结合已有的关于家马毛色基因的研究，根据本文毛色基因SNP位点的检测结果及其所控制的表型特征，对西山遗址出土的这3个古代马样本的毛色进行推测：EQC221应该是栗色（chestnut），EQC222和EQC223应该是骝色（bay）。
三、讨论
本文获得的全部古DNA数据应该都是来自古代马骨的材料，可以排除外源DNA的污染。本研究的实验工作是在专门的古DNA实验室中完成，实验区域完全独立于其他现代分子生物学实验区域，从未进行过现代生物的DNA提取实验，并有正压的空气过滤系统，紫外（254nm）照射，定期次氯酸钠溶液擦拭，以去除残留DNA分子和防止外源DNA污染。PCR前实验区域与PCR后实验区域严格分离，各区域的试剂和仪器严禁相互混用。每次DNA提取与PCR扩增都要设置提取与PCR的阴性对照，用来判断是否存在污染。实验中所有样本都至少提取2次以上，并保证不同次提取产物的结果相同。所有实验结果完全一致才被确定是可靠序列。
考古学发现表明甘青地区可能是起源于西亚和中亚的一些家养动物（诸如黄牛、绵羊、山羊和马等）最早进入中国的地区之一。甘肃省礼县西山遗址出土周时期的文化遗存属早期秦文化的特点，其地理位置亦属于甘青地区。与甘青地区其他古代家马进行DNA比较，可以勾画出一些古代西山家马的遗传特征，为研究甘青地区引入家马过程的研究提供一些新的材料。
为便于对比分析，本文仍然依据Jansen等与McGahern等早期的划分方法。所获得的3个线粒体DNA单倍型分别归属于谱系B和D，进一步细分为单倍型类群B2和D2。在现代家马群体中共有7个谱系，其中谱系A、D、F的分布频率较高，谱系B、C、E、G的分布频率普遍较低。西山遗址的古代马虽然样本量很小，但是既有现代家马群体中高频出现的谱系D，又有现代家马群体中比例较低的谱系B，显示出西山遗址古代家马的线粒体DNA遗传多样性较高。
目前中国古代家马的线粒体DNA研究已发表的遗址共有14个。其中发现有谱系B的遗址有宁夏于家庄和九龙山、陕西枣树沟脑和新疆石人子沟共4个个体，这4个个体与本文的EQC223一样都属于单倍型类群B2（见表四）。并且于家庄的YJZ01、枣树沟脑的EQC10与EQC223共享有相同的线粒体DNA控制区序列。发现有谱系D的遗址有宁夏中庄和九龙山、青海喇家、内蒙古板城和新疆平顶山共7个个体，其中九龙山JLS02H只有部分序列可以判断归属于谱系D但不能进一步划分，喇家有2个个体（EQC229和EQC230）属于单倍型类群D3，除此以外其他个体都属于单倍型类群D2（见表五）。本文属于单倍型类群D2的样本有EQC221和EQC222，其中EQC221与板城LB04共享有相同的线粒体DNA控制区序列，与喇家EQC227相差一个位点15585；EQC222与平顶山EQC90共享有相同的线粒体DNA控制区序列，与喇家EQC227相差一个位点15602，与中庄ZZ04H相差一个位点15659。由此可见，西山遗址古代家马与中国西北地区特别是甘青地区的古代家马表现出更近的母系遗传关系。
本文选择了常见的和研究相对较深入的6种毛色控制基因的8个SNP位点进行检测，结果显示西山遗址出土的3匹古代马中有1匹是栗色（chestnut），另外2匹是骝色（bay），都是马匹中常见的纯色毛色。马匹毛色为马匹毛发身体呈现的颜色，其毛色种类很多，超过一百种，其中黑色、骝色、栗色和灰色为主要的马匹毛色。骝色即英文中的毛色类型bay，身上毛发淡化为枣色（红褐色），四肢、鬃毛和尾毛皆为黑色。以前本课题组在发表文章时多用这种毛色类型的主颜色“枣色”来定义这种类型，但是“枣色”与另一毛色类型“栗色”在颜色上较难区分。通过查阅文献发现，在定义bay这种毛色的时候，中文常用“骝色”或“枣骝”，因此在这里本文使用“骝色”表示，以示区分。
历史文献记载秦人牧马有方。《史记·秦本纪》有：“非子居犬丘，好马及畜，善养息之。犬丘人言之周孝王，孝王召使主马于泾渭之间，马大蕃息”；“于是孝王曰：‘昔伯翳为舜主畜，畜多息，故有土，赐姓嬴。今其后世亦为朕息马，朕其分土为附庸。’邑之秦，使复续嬴氏祀，号曰秦嬴。”秦人始祖“嬴”氏来源、周孝王封邑直至秦人一统天下，都与秦人牧马有方有着十分密切的关系。有研究考证犬丘在今甘肃礼县东部一带，本文研究的西山遗址就在甘肃礼县。且考古发掘认为西山遗址为秦人早期大型聚落遗址，发现了当时所知最早的秦城和时代最早、等级最高的秦人墓，为探讨秦人早期历史和秦早期都邑的建立等提供了十分有价值的证据。其中成一定规模的马坑及相关发现，是研究早期秦人祭祀习俗和宗教活动的宝贵资料。本文的发现则为研究秦人牧马提供了新的线索。
无论是线粒体DNA还是毛色控制基因的核DNA片段，本文DNA提取和扩增的成功率都达到100%，显示出西山遗址马骨的DNA保存状况良好，西山遗址的埋藏环境适于古代动物遗存及其DNA的保存。为我们下一步运用大规模测序技术（Next Generation Sequencing），对“秦人牧马”进行大样本量的古DNA基因组研究奠定基础。基于此，我们将不仅仅是推断古代马的毛色，还可以推断其运动能力、步态等表型特征来探讨马在古代社会的用途。
四、结论
通过对甘肃省礼县西山遗址出土马骨进行线粒体DNA和毛色控制基因的核DNA分析，并结合古代文献记载和遗址的特殊地理位置，得出以下认识：
1.DNA分析揭示西山遗址出土家马的线粒体DNA遗传多样性，与中国西北地区特别是甘青地区的古代家马没有明显的区别。
2.本文研究的样本量很小，但是为研究早期中国古代家马引入中国的路线、中国古代养马业，尤其是早期秦人养马业提供了新的古DNA数据。
3.本文研究显示甘肃省礼县西山遗址出土的动物遗存古DNA保存状况良好，可以进一步对遗址出土的其他动物遗存进行古DNA的研究。
致谢：感谢早期秦文化联合考古队为本研究提供了宝贵的样本，也特别感谢袁靖老师和杨东亚老师为本文的写作提供的非常有益的建议，感谢编辑部老师提出的宝贵意见。
附记：本文在进行讨论时使用了中国古代家马的DNA数据作为对比材料，全部标注了参考文献，特别是陕西枣树沟脑遗址马坑出土马骨的DNA数据，是本课题组的研究成果，并于2015年发表在《南方文物》第3期，特此说明。
（作者：东晓玲 赵欣 吕鹏 中国社会科学院考古研究所科技考古中心，赵丛苍 西北大学文化遗产学院，余翀 中山大学社会学与人类学学院，陈靓 西北大学文化遗产学院，刘铭 张雅军 中国社会科学院考古研究所科技考古中心；原文刊于《南方文物》2020年第4期；此处省略注释，完整版请点击左下方“阅读原文”）