解码人胎儿肝脏造血功能
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摘 要
通过10x Genomics 和 Smart-seq2单细胞测序平台对不同胎龄的14个胎肝样本、7个皮肤样本、3个肾脏样本、3个卵黄囊样本进行测序，获得了138,575个胎儿肝脏细胞及约74,000个皮肤，肾脏和卵黄囊细胞的单细胞转录组谱。推断了造血干细胞/多能祖细胞（HSC/MPP）的发育轨迹，定义胎肝造血过程中红系、淋系及髓系各个阶段的造血细胞，首次发现了胎儿皮肤中存在成红前体细胞，卵黄囊中存在肥大细胞，NK细胞及固有淋巴细胞前体细胞。随着妊娠的进展，胎肝HSC/MPP分化成为红细胞的比例降低，髓系及淋系的比例增高，与此同时HSC/MPP的分化潜能也发生了变化。
方法及分析概览
样品：共收集17个胎儿标本，包括14个肝脏样本、7个皮肤样本、3个肾脏样本、3个卵黄囊标本，其中皮肤、肾脏被称为非淋巴组织（non-lymphoid tissues，NLTs）。样品详细信息如下：
建库测序：10x Genomics样本通过3’ v2 试剂及 V(D)J Reagent Kits建库后通过Illumina HiSeq 4000 测序；Smart-seq2样本通过Illumina Nextera XT kit (Illumina)测序。
数据上游分析：10x Genomics 测序数据通过Cell Ranger软件进行的比对及定量，参考基因组为GRCh38 人类参考基因组。Smart-seq2 测序数据通过STAR软件进行比对。使用htseq-count（v.0.10.0）计算基因的read计数。
质量控制：除去表达< 200个基因且线粒体基因>20％的细胞，除去少于3个细胞中表达的基因。用Scrublet去除Doublets。最终获得了138,575（n = 14）个胎儿肝脏细胞（使用Smart-seq2分析了1,206个细胞），54,690（n = 7）个皮肤，9,643个肾脏（n = 3）和10,071个卵黄囊（n = 3）细胞。10x Genomics平均每个细胞检测到约3,000个基因，使用Smart-seq2平均检测到约6,000个基因/细胞。
降维、聚类及细胞定义：应用Seurat包（v2.3.4）进行数据标准化，scaledata, variable gene detection，PCA、TSNE、UMAP降维，Louvain graph-based 聚类。细胞定义通过经典marker及DEG。胎肝细胞聚类又加用了两种聚类方法：agglomerative clustering及Gaussian Mixture，然后用Rand指数衡量三种聚类方法之间的一致性。细胞定义完后，通过胎肝数据训练support vector machine (SVM)来构建细胞类型分类器，之后用SVM细胞分类器来定义smart-seq2数据的细胞类型。
样本整合：相同组织样本之间整合用Harmony，不同组织样本之间的整合用Merge (Seurat函数)。kBET衡量批次效应。
下游分析：通过比较FDG，PAGA和diffusion-map推测发育轨迹。使用Monocle2中的DifferentialGeneTest函数计算伪时变化的基因。CellPhoneDB推断细胞之间相互作用。
功能验证：免疫组化、免疫荧光、HSC/MPP 培养。
主要结果
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1.构建了胎儿肝细胞图谱
Fig. 1a 实验流程
Fig. 1b 胎儿肝脏细胞图谱
Fig. 1c 各妊娠阶段中每个谱系细胞的比例，胎肝主要以红系造血为主，但随着胎龄的增加，红系比例下降，髓系及淋系比例增加。
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2. 细胞类型鉴定
Fig. 2a 展示胎肝各种细胞类型的marker，*表示后续用于流式分选细胞鉴定的marker。
Fig. 2b 通过选定的marker进行流式分选后，Giemsa染色鉴定细胞类型。
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3. 胎肝及非淋巴组织的造血
Fig. 3a FDG图展示所有的造血细胞，可看到从HSC/MPP向三系的分化轨迹。
Extended Data Fig. 3a 巨核细胞、肥大细胞、成红细胞有共同的前体细胞MEMP (megakaryocyte–erythroid–mast cell progenitor)。分化过程中动态调节的基因不同，红系谱系中的TAL1和KLF1，巨核细胞谱系中的F11R，PBX1和MEIS1，肥大细胞分化中的HES1。
Fig. 3b 从卵黄囊到肝脏，红细胞血红蛋白基因表达以及从原始血红蛋白HBZ和HBE1表达到胎儿血红蛋白（HBA1和HBG2）表达的时间变化。
Extended Data Fig. 3e 肥大细胞，巨核细胞和红系谱系细胞在肝、卵黄囊、皮肤、肾脏中均显示出较高的关联性。
Extended Data Fig. 3d 皮肤MEMPs表达了一些早期的成红细胞基因，包括MYL4，表明这些细胞可能充当皮肤中的红细胞祖细胞，具有造血功能。
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4. 胎肝和非淋巴组织的淋系细胞生成
Fig. 4a & 4b 胎肝及非淋巴组织淋系细胞展示。在胎肝中发现了淋系两个方向分支，NK-T-ILC及B系。与肝脏和卵黄囊相比，非淋巴组织中存在Pro-B，pre-B和B细胞，但缺少HSC / MPP和pre-B前体细胞。
Extended Data Fig. 5h & 5i NLT中的早期淋巴/ T淋巴细胞，NK细胞和ILC与肝脏相比相同的基因表达趋势。然而，趋化因子（XCLI和CXCL8）和细胞毒性颗粒（GNLY）基因的组织特异性表达表明，在皮肤和肾脏中发生了NK细胞的成熟和组织适应性。NLT中的ILC前体细胞缺乏其成熟后代ILC1，ILC2和ILC3的全套特征标记和转录因子。
Extended Data Fig. 5a 根据PAGA， NK细胞（表达NCAM1，CD7，IL2RB和CD3E）和ILC前体（表达KIT，KLRB1，IL7R和RORC）在淋巴分支中具有共同的起源。
Extended Data Fig. 5e HSC / MPP到B细胞分化过程中动态变化的基因包括SPIB，SP100和CTSS。
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5. 髓样细胞组织分布特征
Fig. 5a & Fig. 5b 胎儿肝脏，胎盘和卵黄囊的HSC / MPP，髓系祖细胞，单核细胞和巨噬细胞的FDG图。
Extended Data Fig. 6a & 6b. DC分化涉及CLEC11A，BATF3和ID2的动态调节，而单核细胞分化涉及S100A8 / A9，FCGR1A / 2A和S100A12的动态调节。浆细胞样DC（pDC）前体从早期髓样前体和pre-B前体细胞分化而来，与最近在小鼠中相关研究结果一致。
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6. HSC/MPP分化潜能随胎龄变化
Fig. 6a & 6b FDG展示各个阶段的HSC/MPP。根部的HSC表达CLEC9A, HLA-DRA及最高水平的原始基因如MLLT3，为多能的LT-HSC。
Fig.6c-e 来自CD34 + CD38-CD45RA- HSC / MPP的单细胞培养产生单能和多能的细胞群体。含有红系细胞的细胞群明显减少，而含有NK细胞和B细胞的细胞群则随着胎龄的增加而增加。胎龄小于9周时，无含B细胞的群体产生，提示这一阶段B细胞在胎肝中尚未分化。
Fig 6f-6g胎肝HSC / MPP G0期的比例随着胎龄的增加而增加，表明HSC逐渐趋于沉默状态。与脐带血及骨髓相比，胎肝HSC / MPPs显示编码热休克蛋白（HSPA1A）的基因表达较高，可能用于维持基因组和蛋白质组完整性，而MHC-1（HLA-B）含量较低，表明与抗原呈递能力较低。
总结