完全性基因敲除大鼠构建技术原理及流程

完全性基因敲除大鼠是通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的大鼠模型。

完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。

移码突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠；

2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子大鼠；

3、选择来自同一只F0代大鼠，基因型一致的F1代大鼠，达到性成熟后进行互配，可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代大鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生大鼠。

片段基因敲除鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因不同位点设计、构建相应的一对gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠；

2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子大鼠；

3、选择来自同一只F0代大鼠，基因型一致的F1代大鼠，达到性成熟后互配，可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代大鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生大鼠。

双（多）基因敲除鼠的建系原则与流程

1、通过针对两个靶基因分别设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代多基因杂合子大鼠；

2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代双基因杂合子大鼠；

3、选择双基因杂合子大鼠进行杂交，获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定。