本周hzangs在最新文献中选取了7篇分享给大家。第1篇文章介绍了实时成像追踪多泡体质膜融合来监测外泌体释放，评估外泌体释放效率的实验方法，这种方法的开发有利于我们未来评估不同刺激对细胞释放外泌体速率的影响；第2篇文章介绍了肿瘤细胞利用细胞外囊泡传递药物耐受相关蛋白分子，赋予药物敏感细胞短时间急性耐药能力的分子机制，很有意思的研究，大家可以关注一下；第3篇文章介绍了目前细胞外囊泡在肿瘤免疫及肿瘤免疫治疗等方面的研究进展。相关文章的原文在周一前会发布到论坛同名贴下，需要的可以到论坛下载1.Real-time imaging of multivesicular body-plasma membrane fusion to quantify exosome release from single cells.多泡体质膜融合的实时成像，以量化外泌体从单细胞释放。[Nat Protoc] IF=11.334 PMID：31836866摘要：外泌体是直径为40-150 nm的小细胞外囊泡，与细胞稳态和细胞-细胞通讯有关。它们可以响应细胞外源和细胞内源性信号大量分泌，从而引起多囊体（MVB）与质膜（PM）融合。然而，目前方法无法捕获外泌体释放的动力学，阻碍了外泌体释放调控的研究。在这里，我们描述了如何使用基于四次跨膜蛋白的pH敏感的荧光报道分子进行实时成像，以量化单个细胞的MVB-PM融合率。我们的方法能够识别外源性刺激，信号传导途径和融合复合物，并可以绘制融合事件的亚细胞位点。此外，双色成像可用于评估MVB胞吐作用同时释放不同货物。该实验步骤描述了完整的成像实验，包括四跨膜报道分子的瞬时表达（2 d），活细胞（双色）全内反射荧光显微镜（每种情况下30-60分钟）以及使用新的半自动图像分析开发的ImageJ宏（每个条件±30分钟）。PS：量化外泌体的释放效率对于外泌体相关研究具有十分重要的意义。但是目前技术上依旧存在困难，这篇实验设计报道介绍了一种评估外泌体释放效率的方法。感兴趣的可以了解一下。2.Chemotherapeutic drugs stimulate the release and recycling of extracellular vesicles to assist cancer cells in developing an urgent chemoresistance.化学治疗药物刺激细胞外囊泡的释放和再循环，以帮助癌细胞发展出紧急的化学抗性。 [Mol Cancer] IF=10.679 PMID：31830995摘要：化学疗法是广泛使用的癌症治疗方法。然而，获得性多药耐药性（MDR）的发展是一个严重的问题。新兴证据表明，细胞外囊泡（evs）介导MDR，但其潜在机制仍不清楚，尤其是化学治疗剂对该过程的影响。通过差异离心进行细胞外囊泡分离。根据严格的多参数门控策略，通过荧光激活细胞分选（FACS），从共培养物中筛选获得了ABCB1蛋白阳性的受体细胞。通过流式细胞术测量ABCB1的转移速率。建立小鼠异种移植肿瘤模型以评估体内ABCB1的转移。通过实时PCR和蛋白质印迹检测基因表达。在这里，我们表明，短暂暴露于化学治疗剂可以显着增加Rab8B介导的从耐药细胞释放包含ABCB1的细胞外囊泡（EV），并加速这些EV膜循环到敏感肿瘤细胞的质膜上。因此，细胞间ABCB1的转移明显增强。敏感的受体细胞获得快速但不可持续的抗性，以逃避化疗药物的细胞毒性。更令人着迷的是，在异种移植肿瘤模型中，化学治疗药物也会局部或远距离增加ABCB1分子的转移。此外，一些正在接受初次化疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的单核细胞中ABCB1蛋白迅速增加，这显然与较差的化疗效果有关。化学治疗剂通过Rab8B和Rab5的失调刺激富含ABCB1的细胞外囊泡的分泌和循环利用，从而导致ABCB1细胞间转移的显着增加，从而帮助敏感的癌细胞发展出紧急的抗性表型。我们的发现提供了化学治疗药物如何协助敏感癌细胞获得紧急耐药的新分子机制。PS：细胞外囊泡会介导肿瘤细胞的耐药，这是先前已有很多文章介绍过的。这篇文章研究发现，细胞外囊泡在化疗药物的刺激下从耐药性细胞表面加速脱落，携带抗药相关蛋白转移到其他细胞表面，赋予一些药物敏感性的肿瘤细胞以药物耐受性。文章提出了一种肿瘤急性耐药的模型，很有意思，值得读一读。3.Extracellular Vesicles in Cancer Immune Microenvironment and Cancer Immunotherapy.[Adv Sci (Weinh)] IF=15.804 PMID：31871860摘要：几乎所有细胞都分泌细胞外囊泡（EVs）。它们包含蛋白质，脂质和核酸，它们从亲本细胞传递到受体细胞。因此，它们充当细胞间通讯和分子转移的介质。最近的证据表明，外泌体（EV的一小部分）参与许多生理和病理过程，甚至在癌症发生和转移之前，它们在重塑肿瘤免疫微环境中也起着重要作用。来自肿瘤细胞和宿主细胞的外泌体在局部或远程介导它们的相互调节，从而确定癌症疗法的反应性。这样，源自肿瘤的循环外泌体被认为是用于肿瘤的早期检测和诊断的非侵入性生物标记。基于外泌体的疗法也正在出现，作为可用于抑制肿瘤进展或增强抗肿瘤免疫力的前沿和有前途的策略。本文概述了对外泌体的最新认识及其在调节免疫应答中的关键作用及其潜在的治疗应用。还介绍了当前研究的局限性，并描述了未来研究的方向。PS：肿瘤免疫和免疫治疗过程中细胞外囊泡发挥了一定的功能作用，这在之前的研究报道中已有体现。例如外泌体上的PD-L1可以调控肿瘤细胞的免疫治疗反应性等。这篇文章介绍了目前细胞外囊泡在肿瘤免疫及肿瘤免疫治疗领域的研究进展。4.Genetically Engineered Cell-Derived Nanoparticles for Targeted Breast Cancer Immunotherapy.基因工程化细胞衍生的纳米囊泡用于靶向乳腺癌免疫治疗。 [Mol Ther] IF=8.402 PMID：31843452摘要：外泌体是由各种细胞分泌的纳米级膜状囊泡。由于其独特的和药理上重要的性质，细胞衍生的哇谜题纳米颗粒引起了药物开发人员的极大兴趣。通过用两种不同类型的表面展示单克隆抗体基因修饰外泌体，我们开发了一种外泌体平台，称为合成多价抗体重靶向外泌体（SMART-Exo），用于控制细胞免疫。在这里，我们通过工程化抗人CD3和抗人HER2抗体的遗传展示修饰外泌体，将这种方法应用于表达人表皮生长因子受体2（HER2）的乳腺癌，从而导致SMART-Exos双重靶向T细胞CD3和乳腺癌相关的HER2受体。通过重定向和激活细胞毒性T细胞使其攻击表达HER2的乳腺癌细胞，设计的SMART-Exos在体外和体内均表现出高度有效的特异性抗肿瘤活性。这项工作证明了利用内源性外泌体进行靶向乳腺癌免疫治疗的临床前可行性，并将SMART-Exos用作开发下一代免疫纳米药物的广泛适用的平台技术。PS：目前绝大多数外泌体修饰方法都是先收集再修饰。这篇文章提出了利用遗传工程手段使外泌体携带特定的抗体，靶向不同的细胞。这一策略得到了体内和体外的功能验证，证实这种改造的外泌体具有提升肿瘤免疫治疗的能力。5.Extracellular vesicle (ECV)-modified polyethylenimine (PEI) complexes for enhanced siRNA delivery in vitro and invivo.聚乙烯亚胺（PEI）复合物修饰的细胞外囊泡（ECV），可用于增强siRNA在体外和体内的递送。 [J Control Release] IF=7.901 PMID：31866504摘要：细胞外囊泡（ECV）是细胞分泌的膜颗粒，参与细胞间信号传导和细胞间通信。通过运输各种生物大分子，ECV，尤其是外泌体与各种（病理）生理过程有关。ECV也可被癌细胞释放，并具有促肿瘤作用。它们的靶细胞嗜性，对增殖速率的影响，血液中的自然稳定性和免疫耐受性使ECV作为输送工具尤为吸引人。聚乙烯亚胺（PEI）是线型或支链聚合物，能够与包括siRNA或antimiR在内的小RNA分子形成非共价复合物，以在体内和体外递送。这项研究首次探索了基于PEI的纳米粒子与来自不同细胞系的天然ECV的结合，以递送小RNA。修饰PEI的 ECV / siRNA复合物通过电子显微镜对比ECV或单独的复合物进行分析。在功能方面，我们证明了PEI / siRNA复合物经ECV修饰后，其敲除功效和储存稳定性均得到提高。这与靶向Survivin的ECV修饰的PEI / siRNA复合物增强的肿瘤细胞抑制作用平行。用各种细胞内在化抑制剂进行的预处理揭示了ECI修饰后，PEI / siRNA复合物的细胞摄取机制和生物学活性发生了变化。将我们的研究扩展到针对miR-155或miR-1246的PEI复合抗miR，基于直接miRNA靶基因的抑制，ECV修饰的复合物中剂量依赖性细胞和分子效应得到增强。观察到来自不同细胞系的ECV之间在增强PEI / siRNA功效方面的差异，而与目标细胞系的转染无关。最后，在患有皮下注射肿瘤的小鼠中进行体内治疗研究。基于深刻的靶基因敲低，PC3前列腺癌异种移植物在用ECVPC3修饰的PEI / siSurvivin复合物治疗后显示出明显的肿瘤生长抑制作用。PS：细胞外囊泡是具有巨大潜力的药物递送载体。这篇文章介绍了利用细胞外囊泡与PEI进行相互修饰，利用PEI结合siRNA，利用细胞外囊泡赋予一定的靶向性和更高的稳定性。这一复合型递送载体表现出了更好的储存稳定性和治疗效果。6.Sequential phosphoproteomics andN-glycoproteomics of plasma-derived extracellular vesicles.依次检测血浆来源的细胞外囊泡的磷酸化蛋白质组学和N-糖基蛋白质组学。 [Nat Protoc] IF=11.334 PMID：31863077摘要：细胞外囊泡（EVs）被越来越多地视为细胞间通讯的重要载体，并且是生物标记物发现的有希望的来源。由于蛋白质翻译后修饰（PTM）的状态（例如磷酸化和糖基化）可能是细胞生理学的关键决定因素，因此细胞外囊泡中蛋白质PTM的全面表征对于早期诊断和疾病状态监测尤其有价值。但是，由于纯细胞外囊泡数量有限，PTM蛋白含量低以及生物流体中蛋白质和代谢产物的干扰，细胞外囊泡中PTM的分析变得非常复杂。最近，我们开发了一种从少量人体血浆中分离细胞外囊泡中的磷蛋白和糖蛋白的方法，使我们能够鉴定出近10,000种独特的磷酸肽和1,500种独特的N-糖肽。该方法证明了使用这些数据来识别潜在标志物以区分疾病与健康状态的可行性。在这里，我们提出了一种更新的工作流程，用于顺序分离磷酸肽和N-糖肽，从而能够对同一临床样品进行多次PTM分析。在此更新的工作流程中，我们提高了细胞外囊泡分离，蛋白质提取和磷酸肽/ N-糖肽富集的重现性和效率，从而实现了对从1毫升血浆中分离的细胞外囊泡中低丰度PTM的灵敏分析。工作流程的模块化也仅允许对磷酸肽或糖肽进行表征，并可以对总蛋白质组和其他感兴趣的PTM进行附加分析。采血后，该方案需要2 d，包括EV分离，PTM /肽富集，质谱分析和数据定量。PS：细胞外囊泡上蛋白质的翻译后修饰是潜在的生物标志物来源。这篇操作方法相关的文章提供了详细的实验步骤来介绍如何从少量血浆样本中分离细胞外囊泡并同时用于磷酸化和糖基化修饰分析。这一报道证实了细胞外囊泡蛋白翻译后修饰作为标志物的可行性，并提供了详细的流程共大家参考。更多内容可以关注往期推文：Nature Protocols：血浆EVs的蛋白质组学7.Post-production modifications of murine mesenchymal stem cell (mMSC) derived extracellular vesicles (EVs) and impact ontheir cellular interaction.鼠间充质干细胞（mMSC）衍生的细胞外囊泡（EVs）的生产后处理及其对其细胞相互作用的影响。 [Biomaterials] IF=10.273 PMID：31838346摘要：关于它们在细胞间通讯中的关键作用，细胞外囊泡（EVs）具有很强的潜力，可作为生物源的药物传递系统（DDS）。为了规避它们的一些众所周知的问题（生产产量，载药量，药代动力学），我们特别专注于将这些实体的生物学问题转变为更具物理化学的问题，并考虑和调整细胞外囊泡作为合成载体。为了合理使用，我们首先对鼠间充质干细胞（mMSC）来源的细胞外囊泡进行了完整的理化（大小，浓度，表面电荷，cryoTEM），生化（蛋白质印迹，蛋白质组学，脂质组学，转录组学）和生物学（细胞内化）表征。为了评估最佳储存条件，进行了基于获得囊泡胶体行为的稳定性的评估研究。我们证明了在目标细胞内化效率方面，使用细胞外囊泡代替脂质体的具有一定的潜力。细胞外囊泡被证明是通过小窝和胆固醇依赖性途径被内化的，其内吞途径不同于脂质体。然后，我们表征了几乎细胞外囊泡（通过50 nm膜挤出，冷冻干燥，超声处理）静候物理方法处理后，对细胞外囊泡尺寸，浓度，结构和细胞内在化特性的影响。PS：文章评估了不同的理化处理对细胞外囊泡物理和生物学特性的影响。
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