分子诊断专题 | 分子诊断在结核病检测中的应用

结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，2020年全球约新发1000万例结核病，中国新发结核病约80万例，约20%-30%的人口感染结核分枝杆菌。目前结核病的诊断技术主要有痰涂片染色、细菌培养法、免疫学检测及结核分枝杆菌PCR扩增法等，但是病原学阳性率在临床上仍受到一定限制。

由于在临床中部分患者少痰、无痰或是痰内无法检测到结核杆菌，菌阴性肺结核在结核病患者中占有很大比例。在全国第五次肺结核流行病学调查中，痰菌阴性的肺结核患者占肺结核患者的60%。依据2017年发布的肺结核诊断行业标准，无病原学证据的疑似患者需要依靠临床诊断给出治疗依据，结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应等免疫学检测技术已成为结核病诊断的重要辅助手段。

γ-干扰素释放试验（Interferon Gamma Release Assays, IGRAs）其原理是以结核特异性抗原ESAT-6、CFP-10和（或）其它特异性抗原刺激外周血中特异致敏 T 细胞，通过检测释放 γ-干扰素（IFN-γ）的特异性淋巴细胞数量或直接检测IFN-γ水平来判断机体是否感染结核分枝杆菌，已经成为结核病辅助诊断的重要工具.但在老年人、免疫低下人群中的敏感性尚待提高，而且该技术存在检测周期长、无法当天出结果以及检测过程中人工操作较多等缺点。因此寻找新的诊断方法在菌阴性肺结核早期诊断或是在特殊人群（如免疫力低下患者）中快速发现结核感染有重要意义。

近年来，越来越多的科研学者不断研究除IFN-γ之外的其他靶标在结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应中的应用，其中对于IP-10的研究取得了最显著的进展。而且随者对分子检测技术其快速灵敏的特质研究，将分子检测应用到细胞免疫反应检测对提高结核感染检测的灵敏度，打破传统细胞免疫技术在时间和操作上的客观限制，有重要研究价值。

IP-10作为靶标的产生机制和表达特点：

干扰素诱导蛋白-10（Interferon gamma-induced protein 10, IP-10）一种高表达的趋化因子，在结核抗原刺激下IP-10表达量显著高于IFN-γ。自2007年开始，IP-10逐渐成为一种新的结核病诊断标识物。

IP-10 mRNA 是结核细胞免疫反应更理想的靶标

既往研究都是应用ELISA方法直接检测外周血或经过结核特异抗原刺激后的外周血中的IP-10蛋白含量，尚未有基于IP-10在mRNA水平的瞬时表达量在结核分枝杆菌感染和结核病诊断中的应用。研究发现游离γ-干扰素激活JAK/STAT1通路后IP-10 mRNA大量表达，结核抗原刺激2.5-8小时内，IP-10在转录水平的表达量能够上调百倍左右，因此IP-10 mRNA的高表达量可能有助于提高诊断敏感性。

苏州创澜生物科技有限公司全新自主研发的IP-10.TB产品在分子检测平台上设计采用了产生更快，表达量更高的IP-10 mRNA 为检测靶标，优化结核特异性的刺激抗原肽段，使用灵敏度更高的QPCR检测方法来保证结果更准确。

作为将IP-10 mRNA检测靶标运用到商业化中的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒，IP-10.TB有以下优势：

·受免疫状态影响较小，在免疫低下（受损）人群中有更优异的临床表现

·创新性的使用IP-10 mRNA为检测靶标，优效检测结果：

特异性：>98%  临床灵敏度：>90%

·待检测靶标IP-10 mRNA刺激后瞬时高倍数表达，排除本底干扰，不受基础细胞因子分泌水平的影响，并长时间保持稳定

·全自动PCR检测平台，大幅度降低人员依赖性

·当日即得结果，打破传统IGRA检测隔日等待的局限

·结果判读客观准确，无主观因素影响

·不确定结果比例极低，检测人群覆盖广泛

除了菌阴肺结核外，在临床中结核病患者病原学阳性依然是实验室诊断金标准，但是由于痰培养时间周期长（4-8周），痰涂片敏感性低于30%，远不能满足国家“十三五结核病防治规划“肺结核患者病原学阳性率达到50%以上的需求。

随着分子生物学技术的发展，结核病分子流行病学的研究，分子生物学技术在结核病研究中广泛的应用，2017年肺结核诊断行业标准中分子生物学阳性可作为结核诊断确诊依据。PCR技术已在结核病实验室诊断开展应用，将结核病和耐药结核病的诊断从几周减少到几小时。

耐药结核病传播是耐药结核病流行的主要驱动因素，而传播预防的基础是对所有耐药结核患者进行早期诊断和迅速开始有效治疗。当患者感染利福平耐药或耐多药( 同时对利福平和异烟肼耐药) 的结核分枝杆菌时，患者的临床管理将更为复杂，但是全球仅有 33% 的新发菌阳结核患者开展了抗结核药物敏感性检测。

传统药物敏感实验（DST）培养时间长时间较长（约4-6周），且结果容易受含MTB接种量、细菌活力等多方面影响。相比于传统的培养和表型耐药方法，使用快速分子方法检测可以快速诊断结核/耐药结核，采取有效治疗后可以消除传染性，并有效缩短培养转化时间，提升治疗效果具有重要的临床价值，对降低结核和耐药结核的发病率具有重要意义。

如何应用分子诊断技术快速高效的检测出结核杆菌并在第一时间判读是否耐药，是阻断结核病传播的重要手段，也是目前科研的主要研究方向。

为了更快的在结核病早期发现传染源，确诊结核病，明确结核病耐药情况，帮助临床更好的实施治疗，创澜生物研发的全新产品Innowave MTB-RIF：结核分枝杆菌和利福平耐药突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法）采用荧光定量PCR方法可以实现一次痰标本取样对结核分枝杆菌和利福平耐药同时检测，有效提升结核病病原学阳性率、报告利福平耐药结果同时预测耐多药结核，并且达到国家“十三五”规划的结核病患者病原学阳性检出率50%以上的要求。

结核病的诊断是结核病防治工作的重点，结核分枝杆菌特异性细胞免疫检测与结核分枝杆菌病原体联合检测可显著提高结核病检测的敏感性和特异性，并缩短了检测时间, 同步发现结核耐药，为临床诊疗提供有效证据有着重要意义。

作为专注于感染性疾病诊断的创新公司，创澜生物在结核病检测中不断探索，提供多方面检测平台，满足临床需求。相信在不久的将来，在分子检测领域中，创澜生物会在更广泛的感染领域检测提供更多更好的诊断产品，为临床检测提供更多的帮助！

文章内容由苏州创澜生物科技有限公司提供