科研 | Chemosphere：氯氰菊酯对红螯虾肝脏转录组和蛋白质组的影响
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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氯氰菊酯(CYP)是一种合成的拟除虫菊酯，广泛用于害虫防治，但它对水生生物具有极高的毒性。为了评估CYP对红螯虾的毒性，我们采用转录组学和蛋白质组学方法结合二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和串联质谱来比较肝脏表达谱，共获得41349个unigenes和8839个差异表达基因(DEGs)在此过程中富集。上述结果表明，CYP可诱导红螯虾抗氧化和生物转化调节变化，以抵抗免疫毒性和氧化损伤。还有196种特定的蛋白质差异表达：相对于CYP，24个蛋白表达上调，20个蛋白表达下调。蛋白鉴定表明了人类免疫缺陷病毒1感染的KEGG通路、胰岛素信号通路和流感A富集。从所选9个蛋白的差异表达情况来看，Loc113824800、Rps19、Atp2、Rps10、Hsp40、Brafldraft_124327上调，Loc117331934、Loc113213835、Loc106806551下调。在转录组中验证的八个基因和在蛋白质组学验证的上述九个基因，特别是gpx5, ggt, loc106458463 chelonianin，在0.625 ng L-1 CYP组表达降低；Loc113816050, akr1d1和gst的转录本及chelonianin和loc108675455分别在1.25 ng L-1CYP组中减少和增加。本研究反映了与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的细胞结构和代谢的整体变化。
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实验设计
实验结果
1. 生物测量和RNA-seq，蛋白质组学结果
我们发现治疗组和对照组之间的生物学测量参数，如TG、TL、SCL和SGR，差异无显著性。我们在NR（26.65%）、SwissProt（23.04%）、KOG（20.12%）、KEGG（10.08%）、GO（21.38%）、anno_union（27.99%）和anno_intersection（8.21%）数据库中分别注释了11018、9525、8320、4169、8839、11575和3396个单基因；此后，对41349个（>300bp）、29622个（>500bp）和15569个（>1000bp）单基因进行了分类。单基因长度为301～35848bp，平均为1219.76bp，图S1中的系数矩阵揭示了样本间表达模式高度相似的RNA-seq结果（图S1a-b）。浓度是变化的主要原因，占最大比例（主成分1为41%；P<0.05；图S1c）；另外23%的变化是由主成分2证明的，这可能与饲料效率、浓度或其他参数有关。筛选出的41349个单基因被分为三大类，其中8839个DEGs为显著单基因，三大类是分子功能（MF）、细胞成分（CC）和生物过程（BP）。在BP分类中，前三个亚类依次为：细胞、单体和代谢过程；在CC分类中，前三个亚类依次为细胞、细胞部分和膜；对于MF类别，结合、催化活性和酶调节活性是前三个亚类（图S1d）。在2级中，前三类分别是BP（血淋巴凝固、对cAMP的反应、过氧化氢分解代谢过程）、CC（细胞外区域、空间、微管相关复合物）和MF（丝氨酸型内肽酶抑制剂、丝氨酸型内肽酶、，过氧化物酶活性）在图S1e中显示。最大的三个上调的KEGG途径是翻译（537，图S1f）、折叠、分类和降解（374）、复制和修复（225），而前三个下调的KEGG途径是信号转导（1974）、传染病（1515）和癌症（1182）。
图1 转录组学方法的结果
A-c，不同浓度CYP之间比较的热图: 0.625 ng L-1 CYP vs Con (a), 1.25 ng L-1CYP vs Con (b), 1.25 vs 0.625 ng L-1 CYP (c)。d-f，不同浓度CYP之间比较的“up_”和“down_diff”中排名前20的KEGG途径：0.625 ng L-1 CYP vs Con (d), 1.25 ng L-1CYP vs Con (e), 1.25 vs 0.625 ng L-1 CYP (f)。
2. 免疫系统，代谢丰富的DEGs和疾病聚集的DEPs
有779个（0.625 ng L-1CYP与对照组相比；310个上调，469个下调）、1963个（1.25 ng L-1CYP与对照组相比）和2066个（1.25 ng L-1CYP与0.625 ng L-1CYP）分类基因被归类为显著差异（表S2和图1a-c）。GO富集分析（表S2）确定了0.625 ng L-1CYP组和对照组之间的461项比较（181项上调，326项下调），确定的参考号(https://www.uniprot.org/uniprot/P35926) CK组和T组的蛋白质含量分别为818±28和1269±30。CK和T组共有1215个蛋白，而CK和T组分别有11个和196个特异蛋白（图S1f）。上调和下调的DEPs分别为24和20（表S2和图2a和b），而在一致的存在/不存在表达谱中上调和下调的DEPs分别为107和1。
在这些DEG中，337个GO术语（138个上调，265个下调，P调整值<0.05）和246个GO术语（P调整值<0.01）显示出显著和更高的显著富集。
在10 ng L-1CYP组和对照组之间的比较中，KEGG富集显示86个术语（34个上调，62个下调）（表S3），其中26个富集KEGG项（30个上调，25个下调，P值<0.05）和7个KEGG项（18个上调，9个下调，P值<0.01），三种比较的热图如图1a-c所示。FPKM分析显示，CYP最高浓度与对照组相比出现最高值。
然而，对于Con和0.625 ng L-1CYP组比较中显著上调和下调的单基因，GO:ko00590（花生四烯酸代谢）、ko00860（卟啉和叶绿素代谢）、ko04512（ECM受体相互作用）、ko00480（溶酶体）和ko04151（PI3K-Akt信号通路）被富集（表S3）。免疫系统的KEGG途径、脂质代谢、萜类和聚酮类化合物的代谢、外源生物降解和代谢以及信号转导均下调，而消化系统的途径则上调（图1d）。在这些DEPs中，我们在比较Con和0.625 ng L-1CYP组时完成了152项测试，发现1461个ref蛋白是富含核酸代谢过程、转移酶活性、转移含磷基团、RNA代谢过程和异构酶活性等的DEPs（图2c，表S4）。富集的KEGG途径包括人类免疫缺陷病毒1型感染、胰岛素信号途径和甲型流感（图2d，表S4），此外，帕金森病、亨廷顿病以及内质网核糖体和蛋白质加工途径中共有28种蛋白质富集（图2e）。
在Con和1.25 ng L-1CYP组之间的比较中，DNA复制、芳香化合物降解、己内酰胺降解、抗坏血酸和醛酸代谢以及类固醇激素生物合成被确定为前五条途径，最大的上调和下调途径分别是消化系统、细胞生长和死亡。
在0.625和1.25 ng L-1CYP组之间的比较中，前五个显著受影响的途径是芳香化合物降解、近端小管重碳酸盐回收、抗坏血酸和醛酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化以及视黄醇代谢，而最大的上调和下调途径分别是消化系统和遗传信息处理。
图2 0.625 ng L-1 CYP vs Con 之间蛋白质组学中label-free没有针对性的结果
a, 火山图；b,热图；c, GO富集；d, 富集KEGG通路；e,每个KEGG通路的蛋白数。
3. 证实代谢、降解、核糖体和疾病发生改变
在1.25 ng L-1CYP组中，代表最高峰值的两个上调基因（chelonianin和loc108675455）和六个下调基因被用来验证qRT PCR与RNA Seq结果的准确性（图3）。gpx5和ggt与“花生四烯酸代谢/谷胱甘肽代谢”有关，在0.625 ng L-1CYP组表达为最低峰值，而loc106458463和chelonianin（1.25 ng L-1CYP组显著增加）与“ECM受体相互作用/PI3K Akt信号通路”相关，在0.625 ng L-1CYP组出现最低峰值。loc113816050和akr1d1与“芳香族化合物降解/己内酰胺降解”有关，在1.25 ng L-1CYP组中表达为最低峰值，loc108675455和gst（0.625 ng L-1CYP组无显著差异）分别与1.25 ng L-1CYP组的“药物代谢细胞色素P450”增加和减少有关。
最后，我们选择了6种上调的蛋白质来验证肝胰腺蛋白质组学的质量（表S5）：淋巴器官表达的黄头病毒受体蛋白（Loc113824800）、核糖体蛋白S19（Rps19）、核糖体蛋白S10（Rps10）和Brafldraft_124327（Brafldraft_124327），它们与核糖体途径有关；Hsp40，与内质网途径中的蛋白质加工有关；与阿尔茨海默病/帕金森病途径有关的F1F0-ATP合成酶β亚单位（Atp2）。此外，我们选择了3种下调蛋白：α-L-岩藻糖苷酶样（Loc117331934），与其他聚糖降解有关；液泡膜蛋白1样亚型X3（Loc113213835），与自噬动物途径有关；精氨琥珀酸裂解酶样亚型X2（Loc106806551），与精氨酸生物合成途径有关。
蛋白质组学（表S6）和蛋白质印迹（图4）验证了蛋白质组学方法的准确性，Loc113824800、Rps19、Atp2、Rps10、Hsp40、BRAFLU 124327增加，LOC11731934、Loc113213835和Loc106806551减少。在转录水平上，1.25 ng L-1CYP组的loc113824800、rps19、atp2、loc117331934、loc113213835和loc106806551降低，而0.625 ng L-1CYP组的atp2和loc117331934、loc106806551分别上调和下调（表S7），图5所示蛋白质的基因网络使用字符串数据库。具有不同簇的DEG通过MCODE显示为黄色（图S2），丰富了核糖体、内质网蛋白质加工、阿尔茨海默病、自噬和精氨酸生物合成的途径。
图3 0.625 ng L-1 CYP 和1.25 ng L-1 CYP处理下，不同KEGG通路中DEGs的验证
a，选择DEGs；b，选择蛋白质编码的基因。
图4 WB法对受影响蛋白的验证。
图5 转录组和蛋白质组之间的基因网络结果
结论