科研 | J. Cell Biol:依赖caveolin-1的外泌体生物发生和货物分选的调节所驱动的ECM沉积
编译：小友，编辑：Emma、江舜尧。
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细胞外基质（ECM）的组成和物理性质严重影响肿瘤的进展，但对ECM分层的分子机制了解甚少。肿瘤-基质相互作用主要取决于外泌体（多囊泡体内产生的小囊泡）介导的细胞通讯。我们发现，caveolin-1（Cav1）通过调节内体隔室（LE）/多囊泡体（MVBs）中的胆固醇含量，集中调节外泌体的生物发生和外泌体的蛋白货物分选。定量蛋白质组学剖析发现，Cav1是ECM蛋白货物子集（包括Tenascin-C（TnC））的外泌体分选所必需的，也是成纤维细胞衍生的外泌体有效沉积ECM和促进肿瘤侵袭所必需的，Cav1驱动的外泌体ECM沉积不仅促进局部基质重塑，而且还促进体内远距离ECM富集的基质生态位生成。Cav1在MVB中充当胆固醇变阻器，确定将ECM成分分类到特定的外泌体库中，从而确定ECM沉积。这证明了，Cav1通过外泌体依赖性ECM沉积机制成为肿瘤-基质相互作用的中心调节枢纽。
论文ID
实验设计
实验结果
1. Cav1重新分配到晚期LE/MVB，以在外泌体中进行分类
Cav1的内在化受到了严格的调控。尽管通常认为内吞的Cav1会降解，但不能排除其他情况，我们分析了原钒酸钠处理后内源性Cav1的运输动力学，原钒酸钠通过保护酪氨酸14磷酸化诱导Cav1内在化。原钒酸盐的暴露会增加Cav1的磷酸化和与LE和MVB的共定位（分别为抗溶血双磷脂酸[LBPA]和抗CD63免疫染色；图1A和图S1 A），同样，当细胞暴露于EDTA时，很大一部分Cav1会重新定位于LE/MVB区域，从而通过促进细胞脱离而诱导Cav1内吞。RNAi介导的聚合酶I和转录释放因子(PTRF/Cavin-1)的缺失是维持小窝稳定所必需的一种重要的Cav1外壳成分，也影响了Cav1的部分定位(尽管低于显著阈值)，并增加了Cav1的磷酸化（图S1 C），高分辨率显微镜检查证实了在MVB腔内存在Cav1，与外泌体标记CD63共定位（图1 B）。通过人为地扩大内体，可以清楚地观察到位于MVB内腔内囊泡（ILVs）的Cav1的离散斑块（图1C和图S1D），这些观察结果表明，MVB是内吞Cav1的去向之一。
磷酸化经常触发相邻受体残基的后续泛素化。我们分析了Cav1突变体的亚细胞分布，其中泛素受体赖氨酸残基被精氨酸取代（图1 D，上图），Cav1 N端赖氨酸的突变会破坏Cav1泛素化，其构建体很好地修饰了外部扩大的Rab5内体膜/MVB；然而，N端赖氨酸簇(K5-57R和K5-176R突变体)的突变破坏了Cav1进入ILVs的过程(图1 D)，这与这些突变体与CD63的总体共定位程度较低有关（图S1E），相比之下，C末端赖氨酸残基（K65-176R）的突变不会影响Cav1在MVB中的定位能力（图1 D）。磷酸化在Cav1突变体中没有显着改变（图1 E），这增强了将Cav1分选为MVB的两步机制的概念：磷酸化首先引起Cav1向内MVB膜的内在化，泛素化作用作为Cav1进入ILV的检查点。
为了评估定位于ILV的Cav1库的外泌体分类，我们分析了来自不同细胞系密度梯度纯化的外泌体。内源性Cav1主要与Tsg101隔开，证实外泌体可以携带Cav1（图1 F），在PTRF耗尽的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，Cav1对外泌体的分选得到了增强，相反，N末端泛素化突变体表现出外泌体分类受损（图1 G）。这些数据表明，很大一部分内化的Cav1以泛素依赖性方式分选到MVB内腔，有利于其掺入外泌体，这一过程在所有被测表达Cav1的细胞系中都是基本的。
图1 内部化的Cav1被分类为外泌体
（A）用原钒酸钠（NaV; 2 h）处理后的WT MEF中的Cav1（红色）和LBPA（绿色）的共聚焦图像。白色箭头：质膜定位的Cav1。灰色箭头：Cav1重新定位到核周区域（比例尺，25 µm）。图表显示了Cav1-LBPA共定位的Pearson相关系数。误差线：平均值±SD；n = 80个单元格。蛋白印迹：原钒酸钠处理过的细胞中的磷酸Cav1（pCav1）和总Cav1。（B）Cav1-CD63共定位。右面板显示了MVB隔室的高分辨率图像（比例尺，1 µm）。（C）Cav1在表达Rab5（Q79L）的COS7细胞中的分布（比例尺，10 µm）。右：内体的缩放视图（比例尺，2.5 µm）。（D）上图：被分析的Cav1构建体的示意图。标出了泛素化目标赖氨酸残基（Ub）和突变为精氨酸的残基（X）。下图：用Rab5（Q79L）转染的COS7细胞的共聚焦分析（绿色），并显示了Cav1构建体（比例尺，10 µm）。图表：Cav1变体的内体腔定位（内部，INT；白色）相对于内体膜（外围，MEMB；灰色），以总内体定位的百分比表示。误差棒是平均值±SD；n> 20个内体。（E）在WTCav1（pCav1），泛素化靶赖氨酸突变体和不可磷酸化的Y14FCav1中原钒酸钠诱导的磷酸化的蛋白印迹分析。（F）Cav1包含在成纤维细胞（MEF）衍生的外泌体中。外泌体蛋白的代表性蛋白印迹浮在连续的蔗糖梯度（0.25–2 M）上。收集各个1 ml馏分，蛋白沉淀后将其上样到电泳凝胶上，并分析Cav1和外泌体标记Tsg101。红色矩形突出显示了带有可检测量的外泌体标记物Tsg101（3-7）的级分。（G）表达HA标记的Cav1泛素化突变体的COS7细胞的细胞裂解物和外泌体的蛋白印迹分析。CNTRL，对照；不适用。对于所有图形，*，P <0.05；**，P<0.01；***，P ＜0.001。
2. Cav1通过调节MVB胆固醇含量调节外泌体生物发生
调控MVB膜的构造和组织能够产生不同的ILV和外泌体种群。我们研究了Cav1是否在外泌体生物发生中发挥积极作用，蛋白印迹检测了相同细胞数纯化的总外泌体，蔗糖密度梯度沉降（图2A和2B，下半部分；图3D），结果表明，Cav1KO成纤维细胞的外泌体生成未受到损害，并显示出更高的外泌体分泌率（图2A和2B，A的上部）以及物理特性（Nanosight技术，透射EM [TEM]；图2C和2D）。我们在WT成纤维细胞中鉴定了两个大小不同的外泌体亚群，而Cav1KO成纤维细胞产生了均匀的小外泌体群体（图2C和2D）。
Cav1结合胆固醇并组织专门的膜组织结构域。我们研究了Cav1是否通过调节MVB上的胆固醇水平来促进外泌体异质性，尽管WT和Cav1KO成纤维细胞之间的LBPA阳性结构数目没有差异，但Cav1KO细胞中的MVB面积和filipin强度（代表平均胆固醇含量）明显更高（图2 E）。在WT细胞中，siRNA缺失的Cav1重现了这种表型（图S2 A），用U18666A处理可促进胆固醇在LE/MVB隔室中的积累，也增加了外泌体分泌，同时减少了WT细胞中的外泌体异质性（图2 F）。
ILV中包含大部分MVB胆固醇。我们通过过表达组成型活性Rab5（Q79L）证实了胆固醇在内体中蓄积（图S2 B），为了确认Cav1KO MVB中胆固醇含量的变化是否引起外泌体膜重组，我们从WT细胞（对照或经U18666A处理）或Cav1KO细胞产生的外泌体中分离了耐冷脂筏（外泌体DRM）。Flotillin-1是外泌体和液序（液体有序）域的标记，在Cav1KO细胞（馏分1-8）或经U18666A处理的WT细胞（馏分1-6）中显示出更广泛的分布，相比之下，未处理的WT细胞外泌体中的flotillin积累仅限于馏分1至3（图2 G），反映出Cav1KO来源的外泌体中高度有序的膜含量增加。对外泌体制剂的脂质组学分析证实，PS中，特别是PS（18：0/18：1）物种中有大量富集，与先前的数据一致，值得注意的是，来自WT细胞的外泌体始终表现出较高相对数量的磷脂酸、磷脂酰肌醇和LBPA(已知在ILV的生物发生和动力学中发挥相关作用)，与Cav1KO外泌体相比，外泌体则相反地显示出胆固醇含量的增加，这与在Cav1KO细胞LE/ MVB室中观察到的胆固醇积累相一致。（图S2 C）。这些结果表明，Cav1通过充当LE/MVB处的“胆固醇变阻剂”来调节外泌体的生物发生，赋予该区域可塑性，并使不同的外泌体群体分离。
图2 Cav1通过调节MVB胆固醇含量来调节外泌体的生物发生
（A-G）外泌体是从Cav1WT和Cav1KO成纤维细胞培养物的上清液中分离出来的。（A）上图：来自相等细胞数的外泌体中指定蛋白的蛋白印迹。下图：Western印迹显示Cav1和Tsg101在连续蔗糖梯度上漂浮的外泌体中的分布。（B）相对于细胞数量的外泌体颗粒的定量。误差是平均值±SD；n =10。（C）左：WT和Cav1KO成纤维细胞外泌体制剂的Nanosight分布图，显示出WT衍生外泌体的形态和大小异质性更高。右：在WT和Cav1KO成纤维细胞中鉴定的两个外泌体群体的定量。误差棒是平均值±SEM；n =10。（D）WT和Cav1KO外泌体的代表性TEM（比例尺，200 nm）。从WT和Cav1KO成纤维细胞来源的外泌体的TEM测量分布分布。（E）WT，Cav1KO和U18666A处理过的Cav1WT成纤维细胞（比例尺，20 µm）的菲林染色（灰色）和LBPA（绿色）。下半部分显示缩放视图（比例尺，6 µm）。右图显示了MVB（上部）和总MVB面积（下部）中filipin平均荧光强度的定量分析。误差棒是平均值±SD；n =3。（F）每个细胞的外泌体产量。误差棒是平均值±SD；n = 4（左）和未经处理（对照）且经U18666A处理的野生型成纤维细胞外泌体制剂的Nanosight分布图（右）。（G）在TritonX-100存在的外泌体中蔗糖密度梯度级分的蛋白印迹，所述外泌体由未经处理的WT和Cav1KO成纤维细胞以及经U18666A处理的WT成纤维细胞产生。图表显示了抗洗涤剂和非抗洗涤剂膜（DRM）中的弗洛替林（Flot1）的比例。误差棒是平均值±SD；n =3。对于所有图形，*，P<0.05；**，P <0.01；***，P ＜0.001。
3. Cav1促进将特定ECM货物分类为外泌体
我们定量了WT和Cav1KO成纤维细胞的蛋白组及其相应的外泌体制剂，该分析确定了一个亚蛋白组，该亚蛋白组在WT和Cav1KO全细胞裂解液中同样丰富，但其成分根据Cav1基因型的不同而不同地分类为外泌体（图3A，左），在阈值| Zq | > 1.5的Cav1KO外泌体中，有152种蛋白比WT外泌体中的蛋白丰富，而163种缺乏。相互作用网络和功能注释富集分析表明，WT来源的外泌体显著富集了ECM组分（包括TnC, fibronectin[FN],nidogen, emilin, EDIL3, 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）和内体/内膜系统组件（图3 A，右上图；图3B；图S2 D；和数据S1）；相反，在Cav1KO外泌体中观察到DNA/RNA结合和伴侣蛋白（例如组蛋白）的显著富集（图3A，右下图；图3B；图S2D；和数据S1）。与我们支持Cav1KO MVB中胆固醇含量增加的数据一致，尽管Cav1KO全细胞裂解物中这些蛋白的丰度降低，但各种膜联蛋白家族成员的Cav1KO外泌体含量大大增加（图3 C）。膜联蛋白是Ca2+依赖性蛋白，可以结合富含胆固醇的膜，提供脂质聚类活性，并且可能构成一种机制，以适应Cav1KO外泌体中胆固醇过量的现象。
所选蛋白的差异性外泌体分类通过外泌体组分（图S2 G和图S3 I）和碘克沙醇密度梯度（图3 D）的蛋白印迹分析得到验证。如图3D所示，外泌体标记物和货物的分布显著相关。TnC（Zq = 3.02）是一种涉及发育，干细胞小生境形成和侵袭性肿瘤转移的ECM蛋白，TnC在WT衍生的外泌体中很显著，但在Cav1KO外泌体中却不存在（数据S1）。TnC在成纤维细胞和U251细胞（分泌TnC的胶质母细胞瘤细胞系；图S2 E）的MVB中与Cav1共定位，跨越不同肿瘤细胞系（乳腺癌，成胶质细胞瘤和黑色素瘤）的Cav1敲低（KD）显示了在Cav1KOMEF中观察到TnC分泌减弱的表型（图S2，S2H和S2I），这支持Cav1调节跨不同细胞类型的外泌体生物发生和ECM货物分选，并且是外泌体介导的细胞间通讯的重要调节剂。
图3 Cav1将蛋白货物指定为外泌体
（A）在两个亲代细胞群体（细胞裂解液，黄色阴影）中均表达且在外泌体中差异表达的蛋白的层次分析表示。蓝色：WT外泌体中上调的蛋白；红色：在Cav1KO外泌体中上调的蛋白。右侧的图形显示了STRING网络分析。上图：在Cav1WT MEF衍生的外泌体中上调的鉴定蛋白之间的相互作用。突出显示的组与ECM成分（蓝色）和细胞外囊泡/外泌体生物发生以及溶酶体成分（绿色）有关。下图：在Cav1KO MEF衍生的外泌体中上调的鉴定蛋白之间的相互作用。突出显示的组与组蛋白（红色）和DNA / RNA结合（橙色）有关。（B）WT和Cav1KO成纤维细胞（上图）或组蛋白相关蛋白（下图）产生的外泌体之间ECM蛋白丰度发生显着变化的细胞外蛋白的聚集热图。（C）比较由Cav1KO和WT成纤维细胞产生的外泌体中annexin亚型富集的热图。（D）Western印迹分析显示Cav1和定量蛋白质组学鉴定的一些蛋白在WT和Cav1KO衍生的外泌体中漂浮在Optiprep（碘克沙醇）密度梯度上的分布。Tsg101，Alix和flotillin-1用作外泌体标记，GM130包括作为阴性对照。
4. 外泌体的生物发生/分泌调节ECM沉积
我们检查了外泌体递送的ECM成分是否可以引发从头开始的ECM沉积。缺乏Cav1的成纤维细胞比WT细胞沉积的TnC纤维基质更少（图4 A），在U18666A处理的细胞中，TnC纤维的沉积也减少了（图4B和4C；以及图S3 B），TnC沉积减少与Cav1缺陷细胞中的细胞内TnC积累有关；在用U18666A处理的细胞中这种作用不太明显，可能反映了较高的TnC降解速率（图4B）。在源自Cav1KO和Cav1KD MEF或U18666A处理的WT MEF的外泌体中，TnC含量较低（图4 D和图S2 F），我们使用两种不同的外泌体分泌抑制剂来评估外泌体对细胞外TnC纤维沉积的贡献：二甲基阿米洛利（dmA；H+/Na+和Na+/ Ca2+通道抑制剂）和GW4869（中性鞘磷脂酶[nSMase]-2抑制剂）。WT成纤维细胞的净外泌体释放在GW4869和dmA的作用下有所降低（图S3A），这与TnC纤维沉积受损有关（图4E），两种处理均导致细胞内TnC聚集体的积累（图4 E和图S3 C）。通过减少了外来体分泌抑制剂暴露，也减少了Cav1KO外泌体中代表性不足的另一个关键ECM成分FN的沉积（图3 B，图S3 I和数据S1），而GW4869的作用更强（图4F ），尽管在U18666A处理后未观察到明显差异（图S3 K），在初级CAF中也证实了外泌体分泌与ECM沉积的相关性，其中外泌体的释放在很大程度上被GW4869抑制，而dmA实际上没有作用（图S4A）。因此，TnC和纤连蛋白（FN）沉积受到nSMase2阻滞的特别影响，而dmA没有影响（图S4 B和图4 C），GW4869和dmA均不影响MEF或CAF中的ER-高尔基体稳态（图S3 D，图3 E，图S4 D和图4E），排除了受损的ER-高尔基体分泌功能是造成缺陷的潜在原因ECM组件的沉积。
ESCRT机器调节的运输和神经酰胺生物发生途径会产生带有不同货物的外泌体。我们分析了Tsg101（ESCRT依赖性途径的核心调节剂）或nSMase1和2（神经酰胺代谢的关键调节剂）的瞬时敲低对TnC基质沉积的影响（图S3F和S3G）。与小型抑制剂实验一致（图4 E），任一途径的敲低均会损害TnC沉积，而神经酰胺合成破坏会产生更强的作用（图4G和图S3H）。这些处理还减少了FN沉积（图S3 J）。因此，外泌体是一般的ECM沉积机制，神经酰胺依赖性外泌体生物发生是该过程中的主要限制步骤。
图4 外泌体介导的ECM沉积是Cav1依赖的过程
（A）共聚焦图像Z-stack，显示WT，Cav1KD和Cav1KO MEF沉积的基质中的TnC（红色）。F-肌动蛋白显示为绿色（比例尺，40 µm）。放大视图显示，在Cav1KD和Cav1KO MEF（比例尺，10 µm）中不存在TnC基质沉积，并相应增加了细胞内积累（白色箭头）。（B）通过Z-stack共聚焦显微镜（比例尺，40 µm）测定的U18666A处理的WTMEF的TnC沉积。（C）由Cav1WT，Cav1KO和U18666A处理的Cav1WT MEF产生的纤维中的细胞外TnC沉积（平均值±SD；n = 8）。（D）蛋白印迹法分析指定基因型分泌的外泌体中TnC表达。定量：平均值±SEM；n=6。（E）5-d暴露于外泌体抑制剂dmA（75 nM）和GW4869（10 µM）对WT MEFs的TnC基质沉积（红色）的影响（比例尺，20 µm）。右：图表显示细胞外TnC纤维沉积（平均值±SEM；n = 12）。（F）共聚焦图像Z-stack，显示5-d暴露于dmA（75 nM）和GW4869（10 µM）对WT MEF（FN，50 µm）对FN基质沉积（绿色）的影响。底部：图表显示细胞外FN纤维沉积（平均值±SEM；n = 5）。（G）共聚焦图像的代表性Z-stack，显示靶向Tsg101和中性nSMase1和2的siRNA对WT MEF沉积TnC基质的影响（红色；比例尺，20 µm）。右图显示了纤维中细胞外TnC的沉积，以C表示（平均值±SEM；n = 6）。不适用。对于所有图形，*，P <0.05；**，P <0.01；***，P ＜0.001。
5. TnC掺入外泌体具有细胞内起源，并取决于胆固醇调节
为了排除通过胞吞运输掺入外泌体的TnC的外部来源，我们开发了一种基于细胞衍生基质（CDM）的检测方法，CDM是通过WT或TnCKO MEF在体外合成的ECM脱细胞而产生的，我们证实TnCKO细胞被特异地破坏了TnC的沉积，其他组件（例如FN）没有表现出如此显着的依赖性，并且显示出轻微的上调，这可能是由于存在替代性补偿途径（图5A和图S5A；另请参见图S3I）。然后将TnCKO或WT细胞接种在每个CDM上（图5 B），并确定TnC内在化，在富含TnC的CDM上生长的TnCKO成纤维细胞内部未检测到细胞内TnC，因此排除了胞吞作用是用于TnC库进行外泌体分拣的情况。
为了排除纯化外泌体组分中检测到的TnC来自于细胞外TnC纤维与外泌体非特异性结合的可能性，将来自TnCKO细胞的纯化外泌体与WT细胞产生的富含TnC的基质一起孵育（图5C和材料以及方法部分），与富含TnC的基质孵育后，我们未能在TnCKO外泌体中检测到TnC蛋白（图5 C）。
然后，我们从内质网（ER）和高尔基体隔室中分离了MVB。在未处理的WT细胞中，TnC与MVB和ER标记均被沉降（图5 D）；然而，在用GW4869处理后，TnC基本上被排除在MVB组分之外，这种分布转移在Cav1KO细胞中再次出现（图5 D），因此，在Cav1KO细胞或GW4869处理的WT细胞中，大部分细胞TnC与ER共定位（图5E和图S4F）。补充氯喹后，这种共定位作用得以增强（图S4 F），表明TnC从ER转移到MVB的缺陷会导致ER保留TnC，并随后使溶酶体降解，这支持了溶酶体降解能够在其外泌体分选失败时去除TnC的观点；降解率的差异可以解释外泌体抑制剂药物处理的Cav1KO细胞和WT细胞中TnC积累的差异性，以及在外泌体生物发生和分泌严重中断时内质网缺乏应激。因此，TnC在外泌体中的存在反映了TnC在细胞内被真正调节成MVBs，可能通过涉及ER-MVB接触位点的机制。
膜接触部位（MCS）是小的特殊结构域，通过该结构域，不同的膜隔室进行通信，从而允许离子和脂质（包括胆固醇）在ER内膜MCS的情况下主动转移。我们假设ER-MVB MCS破坏减轻了Cav1KO细胞中的胆固醇积累，并恢复了外泌体上ECM蛋白的分类受损，敲低了ORP1L和囊泡相关蛋白A（VAPA），因为ER-内体系链复合物VAPA：ORP1L的这些成分是ER向内体胆固醇转移的相关调节剂。Cav1KO细胞中这些接触位点的破坏显着降低了LE/MVB大小和磷脂染色强度（图6A和图S5D），在这些接触部位破裂时胆固醇含量的降低与细胞外TnC纤维沉积的挽救相关，其水平与在WT细胞中观察到的水平相当（图6C）。
为了进一步表现内体胆固醇积累在ECM蛋白分类到外泌体上的作用，我们评估了用外源低密度脂蛋白（LDL）-胆固醇加入WT细胞对TnC转运到LE/MVBs中的影响，更重要的是，负载胆固醇的细胞在LE/MVBs处的蓄积和TnC的细胞外沉积均显著降低（图S4，G和I）。
因此，内体隔室中胆固醇含量的控制是调节外泌体生物发生和外泌体货物规格的关键机制，其中Cav1是一个重要参与者。
6. 依赖于cav1的外泌体生物发生直接驱动ECM沉积和肿瘤细胞侵袭性的增加
我们比较了从WT或Cav1KO MEFs中纯化的外泌体在无侵害的乳腺癌肿瘤细胞系MDA-MB468 2D培养物上沉积TnC的能力，该细胞自然表达的Cav1和TnC的水平可以忽略不计。24小时后，肿瘤细胞以相似的效率内化预标记的WT和Cav1KO外泌体，一般膜染料PKH67的积累也类似(图7 A，绿色)；然而，只有WT外泌体可导致TnC在靠近外周的区域可检测到沉积(图7 A，红色)，暴露于Cav1KO外泌体的MDA-MB468的TnC沉积水平与对照组(暴露于vehicle)相当。因此，外泌体具有在体外沉积特异性ECM物质的内在能力，这需要依赖于cav1的外泌体生物发生的调控。
Tav的Cav1依赖性外泌体沉积诱导了MDA-MB468肿瘤细胞的重要形态变化，引起细胞间粘附力的丧失和上皮标记E-钙黏着蛋白的内在化，并与丝状伪足的突出和散发有关（图7 B）。当使用由慢病毒shRNA编码载体转导的CAF系时，观察到相似的表型（图S5C），因此，MDA-MB468细胞显示出增加的迁移，如通过伤口愈合和transwell迁移测定所评估的（图S5，F和G）。有趣的是，从MDA-MB231肿瘤细胞中纯化的外泌体尽管具有相当数量的Cav1蛋白，但与来自WT成纤维细胞的外泌体相比含有较低的TnC，却无法上调MDA-MB468细胞的突出性和运动性（图S5B；图S2G和2H；以及数据S2），因此，来源于基质成纤维细胞的外泌体TnC/ECM货物本身不是外泌体Cav1，而是诱导了肿瘤细胞中侵袭性表型的诱导。
我们研究了外泌体将ECM沉积在MDA-MB468球体的能力，在无支架3D组装中，细胞可以自组织ECM并参与细胞间通讯，并且已被验证为许多应用的活体组织的体外实验替代物。WT衍生的含TnC的外泌体，而不是衍生自Cav1KO或Cav1KD成纤维细胞的外泌体（即TnC耗尽）有效地将原纤维TnC结构沉积在细胞球体内（图7C），3D重建表明TnC原纤维优先位于组织间隙中（图S5 E）。
为了表征在这种情况下肿瘤细胞中Cav1依赖性，外泌体诱导的表型变化，将在外泌体存在下产生的球体铺平，并使细胞迁移72小时，WT外泌体比来自Cav1KOMEF的外泌体显著促进了更多的迁移（图7 D）。为了确认TnC在此过程中的作用，我们测试了源自TnCKO MEF的外泌体的作用（图7 G和图S5，H和I），TnCKO外泌体是刺激细胞迁移的不良刺激物，验证了观察到的表型影响主要来自对外泌体的特定ECM货物的分类。
接下来，我们检查了外泌体是否增加了肿瘤细胞的侵袭性。Cav1KO外泌体在基质胶侵袭试验（图7 E）或3D胶原基质侵袭试验（图7 F）中始终表现出减弱的诱导侵袭能力，类似于TnCKO细胞衍生的外泌体促进的侵袭减少（图7 G），这些结果进一步支持了Cav1和TnC依赖性外泌体诱导的ECM沉积和表型改变与肿瘤进展的相关性。
图5 TnC的外泌体掺入通过ER-MVB途径在细胞内发生
（A）左：TnCWT和TnCKO成纤维细胞裂解液中TnC和FN表达的蛋白印迹分析。右：如材料和方法中所述，从TnCWT和TnCKO细胞生成CDM，并将TnCWT和TnCKO细胞铺在这些CDM上24小时，如图所示。CDM用TnC标记（红色），铺板的细胞用F-actin染色（灰色；比例尺，50 µm）。（B）总裂解物（CDM +铺板的细胞）和铺在CDM上并通过胰蛋白酶消化分离的细胞中TnC和FN的蛋白印迹分析。微管蛋白用作上样对照。在分析之前，将细胞在脱细胞的CDM上培养24小时。（C）纯化的外泌体与富含TnC或TnCKO CDM的相互作用测定。该方案显示了测定方案。Western印迹显示TnC和FN与外泌体结合的分析。（D）使用指示标记，对WT（用媒介物或GW4869处理）和Cav1KO细胞中细胞内TnC分布的亚细胞分级分析。方框区域表示富含MVB的级分。图表显示了在不同条件下，各馏分中TnC相对于MVB富集馏分中总TnC（归一化为1）的相对量（平均值±SD；n = 3）。（E）在单独或与溶酶体抑制剂氯喹组合使用GW4869处理的Cav1WT MEF中分析了TnC（红色）和钙网蛋白（绿色）之间的共定位（比例尺，50 µm；缩放比例尺，20 µm）。图表显示了皮尔逊共定位TnC和钙网蛋白的相关系数（平均值±SD；n = 3）。CNTRL，控制。*，P <0.05；**，P<0.01；***，P ＜0.001。
图6 内体隔室/ MVB处的胆固醇调节控制外泌体介导的TnC沉积
（A）破坏Cav1KO MEF中的VAPA或ORP1L系链后，胆固醇从ER向内体的转移受到破坏，这通过胆固醇（灰度）和LBPA（绿色）染色（比例尺，20 µm）评估了胆固醇的积累。下半部分显示了所关注区域的缩放缩略图（比例尺，6 µm）。右图显示了MVB（上部）和总MVB面积（下部）中filipin血脂平均荧光强度的定量分析。误差棒是平均值±SD；n =3。（B）用Rab5（Q79L）电穿孔的VAPA耗尽的Cav1KO MEF中，TnC分布（红色）和LBPA（绿色）的共聚焦分析（灰色；比例尺，10 µm）。最右边的面板显示了内体/MVB的放大视图（比例尺，5 µm）。图表沿指示线显示了Rab5（Q79L）（灰色）和TnC（红色）的像素强度。（C）Z-stack共聚焦图像，显示RNAi介导的VAPA和ORP1L耗尽对TnC纤维沉积的影响（红色）（比例尺，10 µm）。该图显示了指定的系链耗尽后，WT或Cav1KO MEF沉积的细胞外TnC纤维（平均值±SEM；n = 3）。不适用。对于所有图形，*，P <0.05；**，P <0.01；***，P ＜0.001。
图7 外泌体介导的TnC沉积促进肿瘤细胞侵袭
（A-G）将MDA-MB468乳腺肿瘤细胞与PKH67标记的来自WT或Cav1KO MEF的外泌体或PBS（对照）一起孵育。（A）MDA-MB468细胞摄取外泌体（绿色）并在肿瘤细胞周围区域沉积外泌体递送的TnC（红色）的显微图像。比例尺，30 µm。（B）暴露于成纤维细胞衍生的WT和Cav1KO外泌体后36小时，MDA-MB468细胞的表型变化。对细胞上皮-间质转化标记E-钙黏着蛋白染色；细胞核用Hoechst染色 。放大图像显示E-钙粘着蛋白从细胞与细胞接触部位向细胞内隔室的重新分布（比例尺，10 µm）。E-钙黏着蛋白和其他上皮-间质转化标记通过蛋白印迹法确定。图表显示了用PBS（CNTRL），WT或Cav1KO外泌体处理后E-钙黏着蛋白的变化（平均值±SD；n = 3）。（C）在WT，Cav1KO或Cav1KD外泌体存在下生成的3D MDA-MB468球体中TnC沉积（红色）的Z-stack共聚焦图像。细胞核用Hoechst（蓝色；比例尺，150 µm）染色。放大的图像显示出TnC沉积物的清晰分布（比例尺，50 µm）。白色箭头：TnC纤维。右：图表显示细胞外TnC纤维沉积（平均值±SEM；n =3）。（D）MDA-MB468球体迁移的相衬图像（比例尺，175 µm）。在所示外泌体的存在下产生球体，并培养72小时。该图显示了球体迁移的定量分析（平均值±SEM；n = 11）。（E和F）在成纤维细胞衍生的WT或Cav1KO外泌体存在下产生的MDA-MB468球体的浸润性。在Matrigel中评估侵袭性（E；相差显微镜并定量；平均值±SEM；每种条件下n = 26个椭球；比例尺，150 µm）或I型胶原蛋白凝胶（F；免疫荧光；箭头指示细胞浸润区域；平均值±SEM；每种条件下，n = 24个球体；比例尺，100 µm）。（G）在存在成纤维细胞的TnCWT和TnCKO外泌体的情况下产生的MDA-MB468球体的浸润性。箭头指示细胞侵袭的区域。该图显示了MDA-MB468球状体对胶原蛋白的侵袭性量化（平均值±SD；n =每个条件15个球状体；比例尺，150 µm）。CNTRL，对照；不适用。对于所有图形，*，P <0.05；**，P <0.01；***，P ＜0.001。
7. Cav1WT MEF衍生的外泌体在体内产生富含TnC的生态位
为了评估外泌体是否在大的（器官间）距离内在体内沉积TnC，我们对从WT或Cav1KO成纤维细胞纯化的外泌体进行荧光标记，每天注射到TnCKO小鼠的尾静脉中1周（图8A）。组织病理学分析显示特定的外泌体在肝脏中积累，并在较小程度上在肺中积累（图8 B和图S5 J），然而，仅在注射WT外泌体的小鼠的肝脏和肺中始终可检测到相关的TnC沉积，这与注射Cav1KO外泌体或媒介物（PBS）的动物器官中残留的TnC染色相反，尽管Cav1KO外泌体能够同等效率到达该器官。因此，Cav1在体内依赖外泌体的ECM沉积中起关键作用，由于TnC通过有利的远距离微环境的聚集是转移的正向调节剂，因此Cav1可能通过依赖于外泌体的基质－肿瘤通讯来特异性地调节癌症的结果。
图8 载有Cav1的成纤维细胞来源的外泌体以组织特异性方式在体内沉积TnC
（A）处理方案。（B）用尾巴静脉注射Cav1WT或Cav1KO成纤维细胞来源的外泌体或PBS注射的小鼠肝脏切片的荧光显微镜检查（比例尺，60 µm；放大图，比例尺，30 µm）。外泌体点是绿色的。白色箭头指示TnC沉积区域。所有图像代表来自两个独立实验的九个随机区域。（C）Cav1在外泌体介导的ECM沉积中的可能作用。（CI）内吞的Cav1进入MVB隔室，在那里它促进外泌体的大小和组成异质性，有利于特定ECM成分的进入。（CII）Cav1WT成纤维细胞来源的外泌体通过使肿瘤细胞周围区域的局部ECM（TnC）沉积成核来刺激乳腺癌细胞的突出活性和运动性。（CIII）Cav1WT成纤维细胞来源的外泌体还可以在距体内来源很远的位置生成富含ECM的沉积物，并可能会发生转移。
讨论
外泌体是一种手段，肿瘤细胞和相关基质不仅可以局部交流，而且可以影响和转化远处或“小生境”，甚至系统地调节机体反应。尽管它们无处不在，但外泌体生物发生，货物分选和功能的基本机制仍然难以捉摸。在这里，我们通过调节MVB中的胆固醇含量来确定Cav1是外泌体生物发生的调节剂，从而可以产生不同的外泌体亚群和外泌体货物规格（主要是特定的ECM蛋白），并具有随后的功能影响。我们的数据表明，Cav1在外泌体中的存在通过其Tyr14磷酸化的内吞作用而受到青睐，这促进了Cav1靶向MVB外膜，在该处激活了第二种机制，该机制需要靶向泛素化的N末端域赖氨酸残基的存在。第二种机制将Cav1分为ILV，以产生外泌体，Cav1将在MVB中充当“胆固醇变阻器”，从而增加该隔室的可塑性并实现不同外泌体群体的隔离，在该隔室中的胆固醇滴定还可以通过调节ER-MVB接触来确定外泌货物规格。Cav1依赖性外泌体ECM沉积既引起局部ECM沉积，又引起远处ECM富集区域的生成，支持Cav1在基质重塑中的新作用，这种外体ECM沉积通过增加细胞散射而促进了靶向肿瘤细胞的突出和活跃迁移，表明这些机制有助于肿瘤细胞的侵袭并有利于新的ECM基质位的成核（图8 C）
TnC是参与促进外泌体依赖性肿瘤侵袭的关键组成部分。表达Cav1的成纤维细胞的TnC基质沉积严格要求完整的外泌体生物发生和分泌，我们的数据支持一个模型，其中ER/高尔基体室是TnC向外泌体的主要直接供应者，并排除了从头合成途径绕过的整合，例如从细胞外空间的内在化。在乳腺癌细胞系中进行的研究的支持下，我们的结果表明Cav1调节了外泌体货物规格的一般机制，特别是与TnC分选和分泌有关，此外，依赖Cav1的外泌体TnC分泌对肿瘤进展具有双重影响（图7）:(1) 直接添加重组可溶性TnC后观察到，TnC在肿瘤浸润前部的局部沉积可能会诱导肿瘤细胞从肿瘤块中迁移出来（见图7）；此外，（2）依赖Cav1的外泌体介导的TnC长距离沉积可能会促成基质小生境在癌细胞到达之前“引发”，从而形成随后的转移性生长的“着陆平台”。我们发现，IV注射来自WT成纤维细胞而不是来自Cav1KO细胞的外泌体可以有效地促进远处器官中直接TnC-基质沉积（图8），之后还需要进一步的研究以确认这些ECM基质壁是否对体内转移有影响。
已有描述caveolae内在化的途径，其中caveolae被分解，Cav1被内在化和泛素化，然后在LEs/MVB的内膜积聚。有趣的是，Cav1还通过溶酶体pH值的变化和胆固醇含量的变化而靶向LE，而Cav1降解率没有变化，增加了该Cav1库替代命运的可能性。我们观察到的Cav1-MVB共定位的变化（图1和图S1）：将大部分内部化的Cav1分类为MVB，部分整合到外泌体中，但是，目前我们不能排除其他细胞内隔室（例如ER）也可能是外泌体Cav1的来源。
Cav1以高亲和力结合胆固醇，其在不同隔室之间移动的能力可能有助于调节细胞中的胆固醇通量。我们的数据支持Cav1决定LE/MVB膜中的游离胆固醇水平，为生成大小不等的ILV赋予所需的可塑性，并有利于将ECM组分分类至外泌体以供分泌（图2，图S2，和图S3）。此外，通过在药理学上阻止内体隔室中的胆固醇运输，通过破坏ER-内体MCS（图6和图S5D），对LE/MVB上的胆固醇水平进行人工操作（图2；图4B和4C；图S2 F；图S4 H），或通过外源加上LDL-胆固醇（图S4，G和I），对ECM外泌货物的细胞内运输和外泌体分泌产生深远影响。这暗示了一种模型，通过该模型，内体/MVB的胆固醇水平控制是外泌体介导的ECM沉积调节的必不可少的部分，如最近在这些细胞内区隔中的其他信号传递事件和功能所描述的那样。值得注意的是，ER线粒体MCS的Cav1调节了固醇代谢复合物的募集和胆固醇的积累，之后还需要进一步研究以更好地定义胆固醇运输与外泌体生物发生和下游功能之间相互作用的机制细节，其中Cav1似乎是关键参与者。
有趣的是，在确定的依赖Cav1的外泌体货物中，胶原蛋白的含量不及其他ECM组分丰富，胶原蛋白分泌需要通过COPII生物合成/分泌机制运作的特定组装机制，因此无法用于外泌体途径（图3，图4和图S3）。这些途径实际上可能受到Cav1的相反调控，因为已经描述了Cav1表达与按时间顺序老化的皮肤以及纤维化过程中胶原沉积之间呈负相关。支持我们观察到外泌体可以充当某些ECM蛋白的载体的观点，最近的一项研究表明FN通过与整合素α5β1结合来分泌FN的外泌体的，然而，这种分类的功能和潜在机制尚未确定，我们的数据表明，TnC通过从生物合成途径到MVB室的分类将其掺入到ILV中，不包括通过内化或一旦释放就直接与外泌体结合产生细胞外来的可能性（图5）。
先前的研究表明，黑色素瘤患者血浆中表达Cav1的外泌体水平较高，我们建议表达Cav1的外泌体的相对水平可能是转移和肿瘤恶性肿瘤以及其他胆固醇相关疾病的有价值的预后标志。我们的研究表明，通过外体肿瘤与基质之间的沟通，可以发现诊断，预防和治疗干预的新潜在机会。
https://rupress.org/jcb/article/219/11/e202006178/211453/ECM-deposition-is-driven-by-caveolin-1-dependent