科研 | mSystems：撒丁岛百岁老人肠道菌群组成和功能的代表性研究
本文由流年梦编译，十九、江舜尧编辑。
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意大利撒丁岛上的居民普遍长寿，但是目前尚不清楚这一孤立地区中居民长寿的原因。为了探索肠道微生物群在健康衰老以及长寿中的作用，本研究使用宏基因组测序来确定撒丁岛不同年龄人群肠道微生物群的组成和功能差异。结果显示年轻组和老年组的撒丁岛人的肠道微生物群具有相似的分类和功能特征，但是百岁老人组与他们不同。在百岁老人组中，肠道微生物群与宿主的功能独立性测定相关。百岁老人的核心微生物种类和微生物基因多样性高于年轻组和老年组。我们发现撒丁岛百岁老人的肠道菌群与年轻人和老年人的肠道菌群相比，表现出一种重新排列的分类模式，Faecalibacterium prausnitzii和Eubacterium Rectale的丰度减少，Methanobrevibacter smithii和Bifidobacterium adolescentis的丰度增加。另外，功能分析表明：尽管百岁老人的肠道菌群中编码降解碳水化合物(包括纤维和半乳糖)的酶基因含量较低，但是百岁老人体内的微生物群具有较高的中枢代谢能力，特别是糖酵解途径和短链脂肪酸发酵。该研究为肠道菌群调控提供了新视角。
论文ID
原名：A Cross-Sectional Study of Compositional and Functional Profiles of Gut Microbiota in Sardinian Centenarians
译名：一项撒丁岛百岁老人肠道微生物群组成和功能的代表性研究
期刊：mSystems
IF：6.519
发表时间：2019年7月
通信作者：David J. Kelvin & Ciriaco Carru
通信作者单位：达尔豪斯大学，萨萨里大学
实验设计
本研究收集了三个年龄组的人肠道样本：健康年轻人（n=19），健康老年人（n=25）和百岁老人（n=21）。并同时测定这些样本的临床特征。最后共计59个粪便样本被用来提取DNA并进一步宏基因组测序。移除每个宏基因组样本中属于宿主（人类）的测序数据，物种信息注释使用MetaPhlAn2完成，使用IGC数据库验证。功能注释和量化使用Humann2算法，并获得各基因家族和基因通路的相对丰度。通过比较不同分类水平上的物种组成差异，以及代谢特征差异，解析百岁老人肠道微生物组成及其功能特点。
结果
三个年龄组的肠道微生物组成特征
在门水平上，不同年龄组样本中均发现厚壁菌门，拟杆菌门，放线菌门和变形菌门。百岁老人组样本中的厚壁菌门的平均丰度要低于老人组（P=0.0016），变形菌门的平均丰度要高于年轻组和老人组（P=0.0107）。厚壁菌门和拟杆菌门是肠道微生物中含量最多的两类微生物，他们之间的比值（F/B）被作为评价肠道微生物结构的指标，我们发现百岁老人组的F/B值要低于老人组。
在属水平上，发现物种多样性在在不同年龄组样本中存在较大的差异（图1A）。百岁老人组中Faecalibacterium，Ruminococcus，Corprococcus和Dorea的相对丰度要低于年轻组和老人组（P<0.05）Methanobrevibacter，Pyramidobacter和Desulfovibrio在百岁老人组富集（P<0.05）。
为了进一步解析不同年龄组微生物群落组成上的相似性，本研究采用基于Bray-Curtis距离的PCoA分析进行可视化的聚类分析，结果显示三个年龄组的样本在不同位置被聚类。老年组与年轻组重叠，但有轻微的变化；虽然百岁老人群体中有一些百岁老人的特征与年轻人和老年人相似，但群体的方向与老年人不同。本研究使用ANOSIM分析揭示不同年龄组微生物群落是否存在显著性差异：结果显示老年组和年轻组不存在显著性差异（P=0.464），百岁老人组和年轻组存在显著性差异（P=0.001），百岁老人组和老年组存在显著性差异（P=0.001）。使用MRPP分析表征样本间微生物组成的差异：结果显示百岁老人组为0.76，老年组为0.74，年轻组为0.65；表明百岁老人组和年轻组微生物组成在组内的差异较大，与PCoA分析相似。同时，本研究发现PCoA分析中个体的分布由优势属驱动（图1B），Faecalibacterium，Bacteroides，Roseburia，Sutterella和Parabacteroides与年轻组有关；Eubacterium和Blautia与老年组有关；Bifidobacterium，Methanobrevibacter，Pyramidobacter，Synergistes和Escherichia与百岁老人组有关。图C展示了与各年龄组相关属的相对丰度热图，其中百岁老人形成一个簇，该簇含有较高丰度的Bifidobacterium，Methanobrevibacter和Escherichia。
在种水平上，本研究发现不同年龄组的α多样性没有显著的差异（P>0.05）。进一步，研究了不同年龄组中核心微生物组成的差异（存在于超过50%的样本中），结果发现老年组和年轻组的物种丰富度要高于百岁老人组（图1D）。在相对丰度上，我们发现百岁老人组中属于Bacteroides，Bifidobacterium，Clostridium，Erysipelotrichaceae和Lactobacillus的物种相对丰度较高，其中具有显著性差异物种如图1E所示，其中Faecalibacterium prausnitzii，Eubacterium rectale，和Ruminococcus sp_5_1_39BFAA的丰度较低，而Bifidobacterium adolescentis和Methanobrevibacter smithii的丰度较高。
表1 三年龄组的人口学和临床特征
图1 三个年龄组肠道微生物群组成的动态特征。A 不同年龄组间物种属水平差异，图中表征相对丰度前10的属，其他归属于“ubdominant_Sum”；B 基于Bray-Curtis距离的PCoA分析；C 三个年龄组PCoA中与样品分离显著相关属的相对丰度热图；D 核心微生物群在三个年龄组的分布特征；E 在三个年龄组中，相对丰度有显著差异的物种。蓝色代表百岁老人组，红色代表老年组，绿色代表年轻组。
三个年龄组肠道微生物的潜在功能注释
为了揭示在不同年龄组中肠道微生物代谢潜力是否存在差异，本研究使用Humann2算法对宏基因组测序数据进行计算，获得各基因家族和基因通路的相对丰度。本研究获得384425个基因家族，属于1924个物种；以及463条代谢通路。其中多数出现在肠道微生物中KOs的丰度较低（<0.02%）。年轻组和老年组在KOs组成结构上相似，而百岁老人组的丰度更低。然而，在KOs多样性上百岁老人组显著高于年轻组和老人组（老年组和年轻组之间没有显著性差异）（图2A和B）。
基于KOs的相对丰度，本研究使用PCoA分析调查了不同年龄组之间肠道微生物功能的相似性（图2C）；基于基因通路的相对丰度，使用NMDS分析研究相似性（图2D），结果表明，与基于物种的相似性分析结果相似，老年组和百岁老人组个体间差异较大。老年组和年轻组的功能相似，但是百岁老人组和老年组存在显著性差异。基于ANOSIM检验，年轻组和老年组在KOs相对丰度上没有显著性差异（P=0.465），然而百岁老人组与年轻组和老年组均存在显著性差异（P=0.003，P=0.004）。
虽然不同年龄组之间的基因通路都是一样的，但是优势代谢通路不同。例如，核酸合成和细胞壁合成途径在所有的年龄组中的丰度均较高，但是463条代谢通路中115条的相对丰度在三组之间存在显著性差异（P<0.05），主要分为四大类（图3）。
在中心代谢中（图3A），相比与年轻组，糖酵解途径、磷酸戊糖途径、TCA循环、无氧呼吸在老年组和百岁老人的样本中丰度较高。同时，在百岁老人组中，磷酸转移系统、MFS系统转运蛋白、短链脂肪酸代谢、厌氧能量代谢途径的丰度较高。有氧呼吸途径在老年组和年轻组之间没有显著性差异，但是在百岁老人组丰度较高。
在蛋白和氨基酸代谢相关途径中（图3B），正如所料，与年轻组相比，百岁老人的肠道微生物在大多数氨基酸生物合成途径中的丰度较低，例如赖氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸代谢。同时涉及芳香成分的主要代谢通路，老年组和百岁老人组要比年轻组的丰度高。同时，我们发现以氨基酸为底物（赖氨酸）发酵产生短链脂肪酸（乙酸和丁酸）的代谢通路在百岁老人样本中富集。
在碳水化合物代谢途径中（图3C），年轻组和老年组之间没有显著的差异，但是百岁老人组丰度较低（除了古生菌的淀粉降解途径III，），令人感兴趣的是，半乳糖降解相关途径在百岁老人样本中的丰度也较低。
在维生素代谢相关途径中，本研究发现相对于老年组，百岁老人组样本中富含维生素K2的代谢通路，同时老年组在维生素K2代谢通路中的丰度要比年轻人高。在百岁老人组中，维生素B2合成途径的丰度也较高。关于古菌的辅酶M和F420在百岁老人组中同样被发现富集。但是维生素B1的合成途径丰度在老年组和百岁老人组中较低。
图2 三个年龄组肠道微生物群潜在功能谱的多样性。A和B表示KOs的丰富度和香浓指数分布特征；C 基于KOs特征的PCoA分析；D 基于基因通路特征的NMDS分析。蓝色代表百岁老人组，红色代表老人组，绿色代表年轻组。
图3 三个年龄组肠道微生物群的功能特征。A 中心代谢相关代谢通路；B氨基酸代谢相关代谢通路；C 碳水化合物相关代谢通路。C/E：百岁老人组/老年组；C/Y：百岁老人组/年轻人组；E/T：老年组/年轻人组。
肠道微生物与健康状况的相关性
三个年龄组59名受试者的人口学和临床价值如表1所示。平均而言，百岁老人组在不同的健康参数上得分较低，包括简单精神状态检查(MMSE)、微型营养评估(MNA)和功能独立检测(FIM)，而老年人的得分与年轻人相似。健康参数可能与宿主肠道微生物群组成有关，本研究为探讨健康指标的意义，采用EnvFit分析确定百岁老人健康参数与肠道菌群的相关性（图4）。结果显示FIM与肠道菌群相关，FIM的箭头较长，可能对百岁老人组个体之间较大差异做出解释，这进一步表明，具有相似FIM分数的百岁老人往往具有相似的肠道微生物群组成。本研究发现年龄与FIM没有显著的关联，这进一步表明，百岁老人的健康与实际年龄无关。MNA与FIM存在正相关关系，强调饮食对保持健康衰老的潜在重要性。
图4 肠道微生物与健康状况的相关性分析。图中每个点代表百岁老人样本，其中颜色深浅代表FIM值。FIM：功能独立检测；MMSE：简单精神状态检查；MNA：微型营养评估；BMI：身体质量指数。
图5 撒丁岛百岁老人肠道菌群工作模型。图中显示了撒丁岛百岁老人肠道微生物的组成和功能特征，这些微生物群预期与寿命有关，红色代表高丰度，蓝色代表低丰度。虚线所指代表可能的代谢产物和贡献。
结论
本研究揭示了撒丁岛百岁老人肠道微生物菌群的物种组成和功能特征。基于物种组成特征发现百岁老人肠道中Faecalibacterium prausnitzii和Eubacterium Rectale的丰度减少，Methanobrevibacter smithii和Bifidobacterium adolescentis的丰度增加。同时糖酵解途径和短链脂肪酸代谢可能是维持百岁老人长寿命的潜在原因。同时发现在百岁老人组中，肠道微生物群与宿主的功能独立性测定结果有关，其中微型营养评估结果与功能独立性测定结果相关，证明了饮食对保持健康衰老的潜在重要性。
评论
肠道微生物群已被认为是人类健康的一个决定性因素。本研究中百岁老人的肠道菌群特征有助于我们了解肠道微生物群与健康衰老以及寿命之间的关系。该研究证实了百岁老人体内含有有益健康的微生物群，发现高糖酵解能力和相关的SCFA生产可能有助于人类健康的维持。但是在撒丁岛百岁老人的肠道微生物群中，也发现了编码碳水化合物降解途径的基因含量较低，这通常与肠道健康状况较差有关。总的来说，该研究扩展了之前与衰老相关的肠道菌群研究。
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