科研 | 浙江大学陈红: 抗生素耐药性的流行与传播和人与水环境中微生物菌群的关系
本文由艾奥里亚编译，十九、江舜尧编辑。
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抗生素抗性基因（ARGs）和抗生素抗性微生物菌群在人类和水环境之间的传播途径缺乏各自独有的特点。本文采用高通量qPCR技术以及16S rRNA基因测序方法，对浙江宁波一个村庄的健康人群和相关水环境中的抗生素耐药基因和抗生素抗性菌进行了检测。其中，人类ARGs的多样性最大，共检测到234种不同的ARGs。在粪便、皮肤和生活污水中ARGs的总丰度分别是河流样品的23倍、2倍和7倍。在农村污水处理系统的进、出水口及污水排放点下游，共检测到53个ARGs和28个菌属。通过网络分析，确定了与ARGs有显著相关性的细菌分类群（P<0.0 1，r>0.8），支持了这些细菌携带ARGs并在人与环境之间传递的观点。分析人体和水环境中的ARGs和微生物菌群有助于确定在这些环境中抗生素耐药性的传播途径和传播动力学。本研究强调了人类对ARGs进入环境的负荷的贡献，并提出了防止这种传播的方法。
论文ID
原名：Prevalence and transmission of antibiotic resistance and microbiota between humans and water environments
译名：抗生素耐药性的流行与传播和人与水环境中微生物菌群的关系
期刊：Environment International
IF：7.297
发表时间：2018
通信作者：陈红
通信作者单位：浙江大学
实验设计
本研究中23岁至50岁的健康男性和女性志愿者招募于浙江宁波城郊的一个村庄。经受试者同意后，分别收集6名男性和4名女性的粪便微生物群落（记为F1-F10）和皮肤微生物群落（记为S1-S10）。同时对该村庄9个水体样本进行收集（记为W1-W9），这9个水体样本代表不同水样，依次为饮用水处理进水口（DWTP，W1），DWTP进水口（W2），自来水（W3-W5），农村生活污水处理进水口（RDSTS，W6），RDSTS出水口（W7），上游水体样本（W8）以及下游水体样本（W9）。为了排除时间异质性，在三天内采集了三次水样。在无菌聚乙烯瓶中收集三份水样，每个水样预先清洗两次。所有样品都在冰上运输到实验室，在4°C下储存。
实验结果
1 人类和水环境中的持久性细菌
在粪便、皮肤以及水体中的细菌群落组成差异显著（方差分析R=0.7579，P<0.001）。人的粪便中以Bacteroidetes和Firmicutes为主，占细菌16S rRNA基因序列的89.5%，皮肤中以Actinobacteria和Proteobacteria为主（占69.3%），水环境中以Bacteroidetes和Proteobacteria为主（占70.2%~86.1%）（图S1）。为了进一步研究ARGs在水环境中的转移，我们示踪了细菌在粪便和不同水样之间的循环。在粪便、进水、出水以及下游样本中共发现28个持久性细菌属，这里称为Ⅰ型细菌。此外，共有9种细菌进存在于出水口而不存在于河流中，这里称为II型细菌，大约37个细菌通过处理被成功去除，因为它们只移动到进水样品，这里被称为III型细菌。
经处理后，I型细菌难以去除，且在粪便、进水、出水和河流中均表现出较高的丰度。它们可能是持久性AGRs的宿主随后转移到了水生环境中。相比之下，II型细菌在河流下游并未被检出，这些细菌通常是厌氧或兼性厌氧细菌，可能无法在好氧的河水中存活。III型细菌可通过处理而被去除，这些细菌通常是肠道细菌，可能不能耐受污水处理。细菌种类组成的变化会影响AGRs的分布，尤其是如果这些ARGs位于染色体上，而非可遗传因子上。
图S1 在不同样本类型中细菌门的百分比
2 不同环境下ARGs的特征
采用高通量分析qPCR数据（HT-qPCR）的方法，在粪便、皮肤和水中检测到的不同抗性基因总数分别为234、150和226个。与总数相比，个体样本的多样性较低，其中在粪便样本中的多样性最高（149个ARGs），皮肤样本中的多样性最低（21个ARGs）。总的来说，粪便样品、河水、污水进水和出水的多样性最高。饮用水处理厂、自来水和皮肤的多样性较低（图1a）。编码对β-内酰胺类、MLSB、四环素、氨基糖苷类、万古霉素等抗性基因几乎存在于每个样本中，但相对丰度有所差异（图1）。由于每个样本类型的细菌负荷有很大差异，基于16S rRNA基因的丰度作为细胞数量的代表，我们将ARGs的丰度标准化为每个细菌细胞的拷贝数（图1b）。粪便样本中每个细胞的ARGs数量最多，这些ARGs涉及对四环素、β-内酰胺和MLSB产生耐药性的基因。
图1 人粪便（F1-F10）、皮肤（S1-S10）和水（W1-W9）中抗生素耐药基因的多样性和丰度。根据16S rRNA基因丰度，检测到的不同的ARGs数量（a）以及归一化为每个细胞拷贝的抗性基因丰度（b）。
在所有粪便样本中均发现了一些特殊的ARGs基因，并以高丰度存在。这些基因包括aacA_aqhD、cfxA、ermB、ermF、tet (Q)、tet (X)和tet (32)。在皮肤样本中均发现了高丰度的cphA-01，fox5，mepA，strB以及ttgB，这表明在细菌生活的不同的生态位驱动下，ARGs在人体中的分布是不同的。PCoA证实了ARGs在样本类型中的相似性（图2），其中粪便样本成簇的聚集在一起，并与皮肤样本良好的分离开来。与低丰度和低ARGs多样性的结果一致（图1），来自饮用水处理厂的样本聚集在一起，而剩余的水样本单独分散。基于PCoA分析，饮用水和人体皮肤样本聚集在一起（如W3，W4），这一结果表明了饮用水和人体皮肤之间的关系。以前的研究通过使用动物来证明饮用水对小鼠肠道细菌群落的影响，但饮用水中的抗生素耐药基因对人类健康的影响尚不清楚。
图2 ARGs在粪便、皮肤和水中的分布。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA），显示了ARGs在不同样本中的总体分布模式
ARGs在粪便样本中的丰度在5×105到4.5×1012/g范围内，在皮肤样本中的丰度在1.3×103到1.3×106/cm2范围内（图S4），而在水环境中的丰度更低，在3.9*103到8.7×1010/L范围内。而在水环境中的可遗传因子（MGEs）的丰度在1×105到3×1010/L范围内（图S4）。在这些水体样本中，RDSTS出水口含有较高丰度的ARGs（图S4f），这表明与城市污水处理系统相比，RDSTS对AGRs的去除效果较差，同时RDSTS可能是ARG复制和传播的热点。农村生活污水处理系统中ARG多样性较高，对几乎所有的抗生素都产生了耐药性，表明它可能是将ARG转移到环境中的主要路径。
图S4 ARGs的多样性和绝对丰度。a-c表示粪便、皮肤和水样中ARGs的Shannon-wiener和Simpson指数；d-f表示粪便、皮肤和水样中ARGs和MGEs的绝对丰度，分别以/g、/cm2和/L的拷贝数表示。
3 人类和水环境中的持久性ARGs
为了了解ARGs在水环境中的传递，我们示踪了ARGs在粪便和不同水样之间的传递（图3）。在粪便、污水进水、污水出水口和流出口下游的河流中共发现53个ARGs。这些ARG是持久的，并且不是通过处理而去除，这里称为I型ARGs。共有32个ARGs仅存留在出水口，而在河流中并没有检出，这里称为II型ARGs。此外，共有43个ARGs仅存留在进水口，这里称为III型ARGs。在粪便中发现的大量ARGs同样也存在于处理厂的进水口中，但由于稀释的原因，在污水处理厂进水口ARGs的丰度较低。这些ARGs中有很大一部分没有通过污水处理厂处理而去除，因此在出水口可以被检出。在污水处理厂处理过程中，某些ARGs的丰度有所下降，这可能与它们所对应的微生物体的去除相关。当细菌经过处理优先被去除时，位于染色体上的抗性基因更容易被去除，但当两个物种间发生水平基因转移，这种抗性基因很有可能由于这种基因转移而存活下来。一部分AGRs在河水中并没有被检出，这有可能是因为它们所居住的生物体不能在河流水环境中生存。图3中的分析显示了ARGs的不同存活率，显示了从人类到处理厂，再流出，然后再回到接收河流的传播过程。
图3 不同环境人体和水样中ARGs的绝对丰度。红色点（n=53）代表粪便、进水、流出口和下游河流中出现的ARGs；这些ARGs具有持久性，经过处理后无法被去除，称为I型 ARGs；一些ARGs仅存留在出水口，而在河流中并没有检出（n=32，绿色点），这里称为II型ARGs，而一些ARGs通过处理而被去除，仅在进水后中被检测出来（n=43，蓝色），这里称为-III型ARGs。
4 人与水环境中细菌和ARGs共存的研究
为了解决特定的细菌物种是否可以寄主特定的ARGs的问题，通过网络分析（图4）探讨了ARGs和细菌类型的共生模式。网络的可视化由137个节点（代表I、II、III类ARG或细菌的节点）和256个边组成。网络模块化指数为0.741（值>0.4），说明网络具有显著的模块化结构。同一模块中的基因之间的相互作用可能比与其他模块中的基因有更频繁的相互作用。这些基因可能由某些特定的MGEs或细菌携带，然后可以在不同的环境之间共享类似的动力学和传输过程。确定ARGs和细菌的共存将有助于示踪他们在人类和水环境之间的传播，并识别新出现的ARG亚型，然后这些亚型可以用于控制ARG在村庄群落间的传播。
如图4所示，I型ARGs和I型细菌聚集在一起，并且在网络内相互作用更为密切。这种聚集性表明，这些ARGs可以在类似的持久性细菌中的存在，通过进水口、流出口从粪便中转移到河流中。该网络基于相关性绘制，因此无法将特定的抗性基因的存在位点分配给特定的细菌属。然而，与I型细菌相关的I型ARGs很可能集中在这些细菌中，并且具有在细菌属之间发生水平基因转移来共享ARGs的风险。
对于某些Ⅱ型和Ⅲ型ARGs来说，网络分析表明他们与特定细菌属之间的关系较弱。在Ⅲ型细菌和Ⅲ型ARGs中，Clostridium与MLSB耐药基因（mefA）的ARG亚型相关，Enterococcus（ermk-02）与四环素耐药基因（tetS）相关。这些联系在以前的研究中已经有报道。
图4 描述ARGs与细菌共生模式的网络分析。节点按ARGs和细菌属的类型着色，链接表示具有很强的相关性关系。
基于网络分析允许对ARGs流经不同环境的命运进行预测。在某些情况下，ARGs可能在污水处理过程中在不同的细胞宿主之间发生水平转移，在其他情况下，ARGs在其宿主细胞死亡时被消除。这样的分析将有助于确定污水处理过程中的关键点，以改善对ARGs的去除。
5 细菌和MGES对ARGS分布的影响
基于冗余分析，探究了整个ARG图谱与细菌群落之间的关系（图S5）。两个轴共解释了70.5%的总变异度。Bacteroidetes，Firmicutes以及Fusobacteria与Axis1和对氨基糖苷类、β-内酰胺类、MLSB以及和四环素耐药基因显著相关。ARGS的总丰度与MGES呈显著正相关（P<0.01，r=0.989）（图5）。表明了ARGs和MGES在所检测的样品中可以出现共生的现象。反过来，这表明，持久性的ARGs大部分生存可能取决于它们在MGEs上的居住，在那里它们有能力在不同的细菌物种之间移动。我们的结果和以前的研究一致地表明MGEs对ARG分布和传递的潜在影响。
图5 ARGs丰度与MGEs丰度之间的相关性。
图S5 细菌与ARGs之间相关性的冗余分析（RDA）。
总结
本研究发现，人类是导致ARGs进入环境中的主要贡献者。在这种情景下，ARGs可以来自于水、食物、家畜或其他村民。随后，ARGs在肠道和皮肤微生物菌群中定居，而携带者ARGs的微生物，通过洗涤或污水进入废水当中。本研究发现，污水处理系统确实可以清除部分细菌和ARGs，但仍有大量的细菌和ARGs在处理过程中幸存下来，最终排放到河流中。通过该系统的幸存的ARGs可能是在处理过程中，由细胞或者微生物间的水平基因转移所驱动。了解不同环境间的运动机制是更好地控制抗生素耐药性的第一步。根据本研究的结果，我们提出了控制抗生素耐药性的可行方案：1）控制农村和城市诊所对抗生素的使用，特别是个人抗生素的使用，同时提高农村居民对ARGs的认识；2）重点消除农村DWTP中的ARGS，以提供低ARGs丰度的饮用水；3）在农村地区设置更多的RDSTS，以提高污水收集率，加强尾水处理。
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