科研 | ISME：解密——多物种生物膜中细菌互作和空间组织之间的潜在联系
编译：小鹿同学，编辑：十九、江舜尧。
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环境微生物生活在复杂的多物种群落中，具有独特的空间组织（生物膜）。微生物群落中各个物种之间存在着合作、竞争等复杂的互作关系，甚至可能会产生单个物种不具备的新型群落特性。然而，产生这种现象的分子机制却并不清楚。本文以几个关键物种形成的生物膜为研究模型，通过分子生物学、生物信息学等手段揭示了三物种生物膜及四物种生物膜条件下，群落新型属性（如空间结构、总生物量等的变化）与不同物种基因表达水平之间的联系。本研究也是首次将基因表达与群落的空间结构联系起来，揭示其中的内在联系。
论文ID
原名：Deciphering links between bacterial interactions and spatial organization in multispecies biofilms
译名：解读多物种生物膜中细菌互作和空间组织之间的联系
期刊：ISME Journal
IF：9.493
发表时间：2019年8月
通讯作者：Søren J. Sørensen
通讯作者单位：南京师范大学食品与制药工程学院；丹麦哥本哈根大学生物学系微生物方向
实验设计
本研究从土壤微聚体中分离出四种细菌菌株，分别编号：S. rhizophila （2），X. retroflexus （3），M. oxydans （5）和P. amylolyticus （7）。首先，研究者对这四种细菌做三种生物膜的组合（分别是235,257和2357），然后在连续滴流生物膜反应器（DFR）中培养24h后，采用结晶紫测定法（CV）和活细胞计数法分别对三种组合的生物量及活细胞数目进行统计分析。同时对三种组合的生物膜进行空间定位分析及3D成对相互关联分析（PCC），从而以图像的方式展现生物膜三个定义层中细菌的分布情况。其次，研究者也对三种组合的生物膜进行总RNA的提取、纯化和测序，从而得到各种组合下细菌的表达情况，对其进行生物学分析和统计学分析。
结果
三物种和四物种生物膜中的独特空间结构
作者之前的研究发现，两种三物种生物膜（235,257）与四物种生物膜（2357）相比能够表现出独特的空间结构（图1），其中这两种结构的类型可以基于X. retroflexus（菌株3）和M. oxydans（菌株5）的分布模式来定义。根据刘等人之前的报道，在滴流生物膜反应器中孵育24h后，P. amylolyticus（菌株7）在三物种生物膜（257）群落中作为S. rhizophila（菌株2）的一种内部微群落，表现出明显的分散生长态势，类似于通过单一培养方式实现的空间模式。然而，本研究通过CV鉴定发现四物种生物膜聚生体的空间组织结构发生了明显变化，因为X. retroflexus的出现促进了菌株7的定殖（图2a；单向方差分析，P<0.01），随着观察到的增加总生物量的产量，菌株7在生物容量方面表现出明显的优势。
图1 所研究生物膜的空间结构及实验设计的概述。共聚焦显微镜图片展示了由S. rhizophila （2, 绿色），X. retroflexus （3, 黄色），M. oxydans （5, 紫色）和P. amylolyticus （7, 红色）组成的三物种生物膜（a，b）和四物种生物膜（c，d）的空间组织。展现在c、d图中拥有独特空间模型的样品是在同一种生物膜中不同位置收集得到的。放大率：×40。比例尺：50μm。在四物种生物膜中2357（S）和2357（T）分别代表局部区域有缺失（S）和典型情况（T）。e. 三物种生物膜和四物种生物在DFR系统中孵育24h后，从玻片上刮下来，提取mRNA并纯化，基于Illumina MiSeq平台测序。在三物种群落和四物种群落之间进行宏转录组学的比较分析。
图2 细胞数目和三物种、四物种生物膜孵育24h时的单个物种分布。a.不同群落中单个物种展现出独特的细胞密度，然而，总细胞数没有明显不同。b.顶层、中层和底层生物膜的定义：顶层定义为从最上面到生物容量占据60%的位置；底层定义为在生物容量堆叠的最下面任意20%的部分；中层定义为除顶层和底层剩余的部分。c.根据相对生物容量将每个物种以像素点的形式在生物膜的定义层（顶层、中层和底层）中展现。2：S. rhizophila；3：X. retroflexus；5：M. oxydans；7：P. amylolyticus。2357（S）和2357（T）分别代表在四物种生物膜中局部区域M. oxydans（5）的缺失（S）和典型存在（T）。因为其极低的丰度，菌株5在聚生体235和257中并不能看到。
本研究中获得的空间定位分析进一步证明了之前观察到的现象。物种（2/3和2/7）在三物种生物膜（235和257）的三个定义层中维持着相对稳定的生物容量（图2b，c）。菌株5主要占据三物种生物膜（235和257）的底层，但在整个三物种生物膜中的生物容量极低。然而，四物种生物膜的两种类型（S和T）（图2c）强烈地促进菌株5的定殖，且菌株5主要占据着顶层。菌株3主要占据四物种生物膜（图2c）的顶层，但其丰度/密度会因为菌株7的出现而大大减少（图2a）。
对CLSM产生的预处理堆叠图像进行成对相互关联分析（PCC），输出指示着两个物种之间是否倾向于混合（PCC<1），随机分布（PCC=1）或分离（PCC>1）。具体来说，与三物种生物膜（235）相比，菌株7在四物种生物膜（2357）中的存在大大增加了成对物种2/3和3/5的混合模式，但它并没有影响到成对物种2/5物种之间距离（<10μm）的相对定位（图3）。与三物种生物膜（257）相比，成对物种5/7在四物种生物膜（2357）中的模式更加倾向分离，而成对物种2/5则更加倾向混合，但成对物种2/7的混合模式却没有受到明显影响（图3）。另外，来自孵育24h四物种生物膜（2357）中成对物种2/5，3/5和5/7在菌株5存在的典型区域和缺失区域两种类型下表现出独特的空间定位特性，而成对物种2/3和2/7在这两个类型的区域中表现出类似的混合模式。
图3 三物种和四物种生物膜的成对互相关联分析。PCC平均值（实线）和平均值标准差（阴影区域）是相对间隔为1μm绘制的。虚线水平线（PCC值为1）对应于随机分布。PCC值表明两个物种是否倾向于混合（PCC> 1），是否在特定物种间距离处随机分布（PCC = 1）或彼此分离（PCC <1）。2：S. rhizophila；3：X. retroflexus；5：M. oxydans；7：P. amylolyticus。2357（T）代表在四物种生物膜中M. oxydans存在的典型局部区域（T）。
宏转录组学和表达模式
宏转录组学文库是由四物种和三物种生物膜建立的。研究者在去除核心的相似蛋白质序列后，将120万个转录本定位于样品的基因组上，样品大小平均在3-8百万个reads之间。在CFU标准化之前物种（2/3和2/7）在三物种和四物种聚生体中表现出相对独特的蛋白编码的转录本（图4a）。
图4 三物种和四物种生物膜的宏转录组学分析。a. 三物种和四物种生物膜孵育24h时每个物种的编码蛋白转录本的百分比。b. 基于从待测聚生体中获得的mRNA谱进行冗余分析（RDA）。
基于在CFU标准化之前从mRNA谱中获得的Bray–Curtis不相似性的冗余分析（RDA）通过文库大小标准化计数后再进行（图4b）。根据各自样品的生物膜聚生体，样品呈现出显著的非随机分布（P=4.1E-3），使它们易于进行成对的统计学比较。第一组分离的生物膜聚生体235是从257和2357中得到的（RDA1，79.7%），这表明菌株7的出现或缺失与更多生物容量的产生没有相关性。另一方面，第二组清楚的显示出生物膜聚生体257与其他组（聚生体235和2357）之间的分离（RDA2，9.4%），表明菌株3的出现或缺失是此次统计分析中第二个重要的方差来源。
三个群落的差异表达功能基因的定量分析
经标准化后的成对差异基因表达分析检测到387个RAST遗传性功能的基因，这些基因在四物种与三物种群落之间的表达水平有显著地改变。在三物种生物膜（235）中菌株2和菌株3共用81%的功能性表达基因，因此将这两种归类到SEED数据库中，而这是根据它们密切的系统发育相关性而预测的。然而，在四物种生物膜中这两个物种共存时，这个共用功能性表达基因的百分比急剧下降到43%，同时这两个菌在响应菌种7时的基因表达谱显示出明显地不同。此外，与应用生物量标准化时三物种生物膜（257）相比，菌株2和7在四物种生物膜聚生体（2357）中就差异基因表达而言对菌株3没有表现出明显的响应。
与三物种生物膜聚生体（235）的对照表达水平相比，分别来自菌株2和菌株3的64个、314个遗传性功能基因在四物种生物膜（2357）中响应菌株7时表现出差异表达。在这些功能性基因中，菌株3中有312个基因上调（只有2个下调），然而菌株2中有62个基因被下调（仅有2个上调），表明这些关系密切的γ-变形杆菌对菌株7有着显著却相反的响应。由于菌株5的低生物量及相应较低的mRNA序列分辨率，因此，并没有遗传性功能基因的差异表达归因于该菌株。然而，“RNA代谢”和“毒力/疾病/防御”中在较高的SEED的分类水平中可以看到差异。
X. retroflexus对P. amylolyticus在基因表达时的积极响应（2357 VS 235）
为了进一步理解菌株2和菌株3在四物种VS三物种生物膜（2357 VS 235）中功能性基因的改变，差异表达的基因被归类到SEED功能，且类别内的分布如图5所示。值得注意的是，上调或下调的遗传性功能基因簇主要被注释为'氨基酸和衍生物’、'碳水化合物’'膜转运’、'呼吸作用’'蛋白代谢’及'应急响应’等。
图5 SEED功能的条形图表示与三物种生物膜（235）中的差异表达相比，菌株2（S.rhizophila，绿色）和菌株3（X. retroflexus，黄色）在四物种生物膜（2357）中的差异表达。左图和右图分别代表四物种生物膜（2357）中下调和上调功能性基因的数目。
在四物种聚生体中菌株3在响应菌株7的出现时有15个被注释为“氨基酸和衍生物”的遗传性功能基因发生了上调。这些遗传性功能基因的蛋白与KEGG数据库进行比对后，提供了一个它们参与特殊代谢途径的概述。具体而言，两种遗传性功能基因（EC 2.1.2.1 和 EC 1.4.4.2）参与到甘氨酸代谢途径，三种（EC 4.2.1.9，EC 1.2.4.4 和 EC 2.3.1.168）参与支链氨基酸（BCAA）的降解有关。由甘氨酸和BCAA降解产生的氨可用于活性谷氨酰胺的合成，这些可以通过glnA(EC 6.3.1.2) 和gltA (EC 1.4.1.13)的上调来反映。谷氨酰胺可能被进一步加工用于氨基酸、嘌呤和嘧啶的代谢，因为催化谷氨酰胺成为底物参与到这些代谢途径所需的必需酶（EC 2.4.2.14，EC 2.6.1.16 和 EC 6.3.5.5）发生了显著上调。参与细胞裂解或细胞壁合成的12个遗传性功能基因，及参与嘌呤或嘧啶代谢的9个基因发生了上调，表明四物种聚生体中菌株3在不断进行细胞复制并发挥其活性。
另外，来自菌株3被注释为“碳水化合物”的15个上调功能性基因中，有3个（EC 4.1.2.13，EC 2.7.2.3 和 EC 4.2.1.11）参与到糖酵解，4个（EC 1.2.4.1，EC 1.8.1.4，EC 4.2.1.3和 EC 2.3.1.61)）与柠檬酸循环（TCA循环）有关。此外，被注释为氧化磷酸化（'呼吸代谢’）有关的14个功能性基因发生了上调，这组数据表明菌株3积极地利用葡萄糖作为碳源进行有氧呼吸。此外，涉及磷酸鸟苷磷酸二酯酶合成的一个遗传性功能基因，及参与鞭毛合成及控制的7个基因均发生了上调，预示着与不含菌株7的三物种生物膜相比，菌株3在24h四物种生物膜中的运动能力得到了加强。对于菌株2来说，菌株3中所有差异化表达的遗传性功能基因都没有表现出明显的不同。
而且，菌株3在响应菌株7存在时上调了7个与氧化还原状态调节（“氧化应激”）有关的遗传性功能基因，说明在四物种聚生体共培养时菌株3受到了影响。这个结果与四物种聚生体中菌株3的活细胞数目比三物种聚生体（235）中数目减少10倍的现象一致。相应的，菌株3中与DNA修复有关的6个遗传性功能基因、蛋白生物合成及降解的13个基因、磷代谢的6个基因和铁离子获取（“膜转运”）的11个基因都存在显著上调。与之相反的，菌株2中8个与铁离子获取有关的遗传性功能基因发生明显下调，但并未表现出与应激反应相关的功能性基因的差异表达。
讨论
生活在多物种生物膜中的微生物占据着不同的位置，非随机分布形成的微菌落随着生物膜的发展而改变，这是由物种间相互作用驱动的局部异质造成的。因此，生物膜提供了一个完美的模型，用来理解新出现的属性如何成为选择的对象。已有研究表明，通过物种间相互作用产生的群落新兴属性所实现的适应性增益是多物种生物膜生态学和进化的主要推动力，其中独特的空间组织结构是至关重要的。最近，专业的计算和实验模型越来越多的应用于群落互作（合作、竞争和促进）和空间组织结构，这些会直接影响到研究者对生物膜的概念观。然而，很少有研究者尝试破解在多物种群落模型中种间互作中潜在的分子机制，本研究首次尝试将基因表达模式与多物种之间的空间组织模式联系起来。
在本研究中，研究者发现三物种聚生体（235）中混合模式的成对物种在四物种聚生体（2357）中响应菌株7时发生了明显变化。据此，研究者提出假设：这种现象与在不同微生物群落中细胞的基因表达谱的变化密切相关。实际上，在四物种生物膜中菌株3在响应菌株7的存在时改变了314个遗传性功能基因的表达水平。具体来说，菌株3显著上调了涉及到糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化等过程的遗传性功能基因，与其存在四物种生物膜的顶层这个空间位置有关，这可以使其利用更多的氧气和葡萄糖。菌株3中涉及到鞭毛合成的遗传性功能基因的表达也上调了，这被研究者认为是菌株稳定共存于生物膜顶层的一种策略。定位于生物膜顶层因可以直接且持续地获取资源，研究者相信这可以直接为菌株提供生长优势，这也是该物种和其他快速定殖物种在生物膜中竞争的一种已知策略。菌株2尽管在进化关系上与菌株3十分相近，但菌株3中所有表达水平发生改变的遗传性功能基因在菌株2中却没有明显的差异表达，这个结果与菌株7是否存在菌株2都能均匀存在三个定义的生物膜层（235和2357）（图2c）这种现象相符。另外，宏转录组谱表明菌株3在与菌株7共培养24时期间受到了影响，菌株3中显著上调了涉及到“应激反应”遗传性功能基因的表达，并且在菌株7存在时菌株3的细胞数目减少了10倍（总CFU数目的7.1%）。根据Herschend等人的报道，在长达48h四物种生物膜的生长中菌株3约占总CFU数目的20.4%，证明该物种在群落中是稳定存在的。总的来说，菌株3积极地响应菌株7的存在以促进其可以占据生物膜顶层，从而利于自身获取营养和氧气，这似乎也是一个群落中更好共存的成功策略。本研究的结果证明了之前观察到的四物种生物膜中菌株3和菌株7空间结构分离现象是由资源竞争导致的，比如氧气和培养基中生长可利用的营养。
之前通过实验已证实，在具有相似代谢途径且关系密切的物种之间，拮抗作用更可能发生。实际上，与单一物种的生物膜生长相比，菌株2和菌株3即使在营养丰富的培养基中也表现出生长状态降低的现象，这表明在这两种关系密切的物种之间存在着竞争关系。本研究中，四物种生物膜中两物种之间的混合水平在响应菌株7的存在时发生了改变，这是由于菌株7的物种优势，中层和底层中仅剩有限的空间可以利用。菌株7可以增强与发酵、硝酸盐/亚硝酸盐氨化相关的代谢活动，研究者因此假设：两个物种之间由于有限的营养资源而使竞争更加激烈。然而，菌株2并没有像菌株3那样出现应激反应相关的遗传性功能基因上调的现象。实际上，菌株2显著下调了与膜转运及铁离子获取等相关的遗传性功能基因的表达，这是营养限制条件下成功竞争的必要条件。研究者的结果表明四物种生物膜中菌株2和菌株3之间的生态位重叠是通过相似基因差异表达最小化实现的，这导致了表型特征的位移。这种功能性生态位移机制可能是促进生物膜等高密度多物种群落中同区域微生物之间资源分配的一个重要策略。
铁离子是一种多用途的氧化还原催化剂，在许多生物学功能和过程中发挥着辅助因子的重要作用。菌株2在响应菌株7时明显下调了与铁离子获取相关的遗传性功能基因，然而，它在四物种生物膜中的生长状态却略有提高。另外，无论菌株3存在与否（257 VS 2357），菌株2中均未检测到显著的基因调控变化，表明菌株2的基因表达谱主要受菌株7的影响（235 VS 2357）。总体而言，研究结果表明，菌株2与菌株7共培养时，通过共享高成本的铁离子清除产物从而促进了菌株2的生长。此外，研究者发现四物种生物膜生长竞争时除了菌株2外，其他均可促进菌株7的定殖，表明代谢依赖是影响其种群动态的一个生物因素。而且，无论三物种生物膜还是四物种生物膜（257和2357）中均未表现出种间距离在30μm内的分离现象（图3），这进一步证明它们通过弱化代谢的相互依赖性、共同合作来促进自身的生长。
研究者在这三个研究的聚生体中没有观察到总活细胞数目的差异，然而，菌株3的存在促进了菌株7的定殖（257 VS 2357；图2a），因此，可以推断四物种生物膜生物量的增加是由大量定殖的菌株7细胞体积造成的。单个物种的细胞数目变化可能会导致不同的群落功能，这通过三物种和四物种生物膜之间的不同混合模式也可以反映（图3）。出乎意料的是，研究者并没有在四物种生物膜（2357）中检测到菌株3对菌株7基因的表达产生任何影响。这可能因为菌株7对菌株3的存在仅产生了局部响应，而这个响应在取样和总RNA分析过程中被平均到了整体。或者，菌株3对菌株7的促进作用并不会通过基因表达模式的改变来反映。这突出了在子群体这个微观水平上研究种间作用的重要性，可以通过共生物种的空间组织从视觉角度来定义。然而，最先进的mRNA测序需要大量的生物体才可以达到合适的提取效率，因此这与目标子群体所要求的精细化采样规格并不相容。另外，PCC分析显示四物种生物膜中两种特定类型的局部区域（S和T）中成对物种之间存在明显的混合模式，表明由于周围微环境的差异可能会导致个体物种异质基因的表达。
在所有三物种生物膜的测试中，由于菌株5相对低的丰度，并未检测到其在遗传性功能基因上差异。然而，可以在更高的SEED分类水平上鉴定到“RNA代谢”和“毒力/疾病/防御”相关基因的上调。RNA代谢是指核糖核酸（RNA）分子生存周期中的任何一种形式，反映了所研究样品的代谢活力。菌株5增加了RNA代谢的表达，并且展现了在四物种生物膜中活细胞总数目增加14倍这样的表型，因此证实了其从四物种群落中获得了生长优势。通常来说，当面临环境条件的压力下，微生物通过上调涉及“毒力/疾病/防御”等相关的基因以保持了其竞争力。菌株5在四物种生物膜中仅响应菌株7的出现而出现毒力等相关基因的上调，表明其与菌株3共存时是受益的状态。基本上，当菌株3和菌株5合作共存于生物膜顶层时，总群落可以获得最多的生物总产量。这样的现象支持了一种假设，即这两个物种之间在顶层空间的混合是由协同互作强烈驱动产生的。因此，这两个物种在四物种生物膜（2357）共培养时被研究者视为关键物种，但在三物种生物膜（235）共培养时却不是。实际上，它们的相互作用将它们变成生态系统中所谓的“生态系统工程师”，被定义为能够显著改变特定生态系统性能的生物体，从而导致栖息地的修饰、维持或创造，比如这种情况下的生物膜。在复杂的环境微生物群落中精确定位这些重要的关键物种十分具有挑战性，而多物种生物膜的模型非常适合解决这一问题。此外，来自菌株7出现的竞争压力下似乎加强了这两个物种间的协同互作。这表明合作与竞争这些相互作用都在增加生物量总产量中发挥了重要的作用。然而应该强调的是，这些探索性发现都需要在详细的机制研究和数学模型测试中得到进一步研究和论证。
总的来说，研究者得出结论，增强生物量总产量的内在群落特性与四物种聚生体微调的空间结构密切相关，其中结合表型特征可以发现，每个物种占据特定的区域以优化其生长的适应性。因此，四物种生物膜中的物种共存似乎通过优化空间结构组织和表型修饰这样的组合来稳定，同时也可以最小化物种间的竞争（图6）。研究者的结果阐明了：当结合实际空间结构组织的视觉成像时，如何更好地解释宏转录组学的数据，并提供了表型特征位移可能稳定生物膜中物种共存的互作关系这样一个框架和展望。此外，研究者的结果强调：应该考虑由局部种间互作驱动的非随机空间结构组织出发，研究复杂多物种群落在亚种群水平上的分子机制的重要性和必要性。
图6 在多物种生物膜中细菌互作与空间组织之间的联系。a. 四物种群落中细菌之间相互作用的总览。箭头末端和线条末端分别表示在生长期间的正（促进）和负（抑制）作用。通过比较每个物种单独培养的生长状态和在三物种、四物种生物膜中与其他物种共培养时的生长状态来预测所有成对物种之间的相互作用。红线表明在本研究中通过宏转录组谱比较已进一步证实的细菌之间的相互作用。b. 研究者提出的策略，为了使微生物群落稳定，增加四物种生物膜的生物量产量。（1）细菌的空间种族分离（比如X. retroflexus和 P. amylolyticus）；（2）在P. amylolyticus的竞争压力下，细菌之间的空间混合程度加强（比如X. retroflexus和M. oxydans）；（3）为了避免由于生物位重叠带来的激烈物种竞争，每个物种发生了一些表型特征的位移（发生在S. rhizophila和X. retroflexus之间），从而可以利用不同的营养资源；（4）弱化物种间的合作（发生在S. rhizophila和P. amylolyticus之间）。虚线表示从mRNA-seq需要预测的信息以支持S.rhizophila是否通过分泌有益于P. mylolyticus的生物分子来促进其定殖。S. rhizophila（绿色圆）X. retroflexus（黄色圆）M. oxydans（紫色圆）P. amylolyticus（红色圆）；方框和三角表示培养基中或细菌分泌的营养物质。
评论
微生物群落中存在着复杂的种间互作关系，也会出现一些新的群落属性。本研究以多物种生物膜为研究模型，致力于从分子机制角度解释多物种群落中种间互作及新兴群落属性出现之间的联系，发现物种间合作或竞争都是其在群落中稳定共存、积极生长的一种策略。同时，研究者还强调：应该考虑在亚种群水平上，研究物种间互作引起表型改变的分子机制。这也为今后研究物种间互作关系提供了一个新的思路！
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