科研 | Food Chemistry：代谢组学分析西兰花摄入后人体尿液和血浆中芥子油苷的代谢物
编译：小太阳，编辑：小菌菌、江舜尧。
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西兰花是一种比较受欢迎的十字花科芸薹属蔬菜，食用西兰花可以降低某些癌症的总体发病率。为了深入了解西兰花中能够诱导人体产生生理反应的代谢物，本研究采用高分辨质谱系统针对芥子油苷代谢物进行了非靶向和靶向的代谢组学分析。选择 6 名健康的参与者开展人体试验，每名参与者每餐食用 200 g 未煮熟的西兰花。
代谢组学分析结果显示，食用西兰花导致参与者体内的内源代谢物发生变化且马尿酸水平降低。采用高分辨质谱可以检测到人体尿液和血浆中浓度较低的芥子油苷代谢物，在人体尿液和血浆中分别检测到了 13 种和 8 种芥子油苷代谢物。
本研究首次发现食用西兰花会导致人体内出现甲氧基吲哚芥子油苷代谢物。尿液中大多数芥子油苷代谢物的浓度会在西兰花摄入后的2-4 h内达到顶峰，而血浆中的芥子油苷代谢物浓度在 2 h内达到顶峰。研究结果表明，萝卜硫苷代谢物（萝卜硫素、萝卜硫素半胱氨酸和萝卜硫素N-乙酰半胱氨酸）和吲哚代谢物（来自吲哚芥子油苷的抗坏血酸和甲氧基抗坏血酸）可能是西兰花摄入的生物标志物。
论文ID
原名：Profiling glucosinolate metabolites in human urine and plasma after broccoli consumption using non-targeted and targeted metabolomic analyses
译名：代谢组学分析西兰花摄入后人体尿液和血浆中芥子油苷的代谢物
期刊：Food Chemistry
IF：5.399
发表时间：2019.10
通讯作者：陈佩
作者单位：美国联邦农业部农业研究局贝尔茨维尔人类营养研究中心
实验设计
1 西兰花中芥子油苷的定量分析
参考ISO9167-1标准对西兰花中芥子油苷总量及每一种芥子苷含量进行定量分析。结果以μmol/g干重表示。
设定 PDA 信号波长为 290 nm对脱硫芥子油苷进行定量检测。采用Xcalibur4.1软件对峰面积进行积分，并借助于高分辨质谱对鉴定结果进行确认。以黑芥子苷为内标并结合使用推荐的相对响应因子对西兰花中的芥子油苷进行定量。使用配备有二极管阵列检测器的 Vanquish 超高效液相色谱进行色谱分析。选用Vanquish Accucore C18 +色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 1.5 μm)用于目标物质的分析。流动相 A 为 0.1%的甲酸水溶液，流动相 B 为 0.1%的甲酸乙腈溶液，洗脱梯度如下：0~10 min，2~50% B; 10~15 min，50~95% B，10~15 min; 15~25 min，95% B，保持10 min，色谱柱再平衡时间为5 min。流速为0.2mL/min，检测波长为229 nm。借助于Q-Exactive高分辨质谱对每一种脱硫芥子油苷进行鉴定。优化后质谱条件如下：鞘气流速为 40，任意单位；辅助气流速为 10，任意单位；且吹扫气流速为 5，任意单位；喷雾电压为−4.0 kV；离子传输管温度为 320℃；透镜射频电压为50 V。质谱扫描范围为m/z 100 ~ 1000，分辨率为 35000，单级轨道阱最大容量为1e6，二级轨道阱最大容量为1e5。源内 CID 设置为 20%。以脱硫芥子油苷作为标准品绘制标准曲线，以脱硫黑芥子苷为内标对目标物进行定量，并根据内标计算响应因子。
2 人体试验设计
从华盛顿地区招募参与者并对其总体健康状况进行筛查。通过临床的血常规和尿常规筛查完成健康史调查问卷以确定参与者是否合格。如果参与者符合以下任何一项标准，将被排除在外：
1）在研究期间已怀孕、正在哺乳或打算怀孕；
2）对已知的芸薹属蔬菜过敏或不耐受性；
3）研究开始前三周内做过结肠镜检查；
4）在研究开始前的三周内使用益生菌；
5）做过减肥手术或患有营养不良的吸收疾病；
6）吸食烟草制品；
7）患有克罗恩病或憩室炎；
8）疑似患有或患有狭窄、瘘或生理性/机械性肠梗阻；
9）2型糖尿病且需要使用包括胰岛素在内的药物或
10）使用血液稀释剂。
3 用于UHPLC-HRAMMS分析的尿液和血浆样品的制备
将尿液样本置于 5000 g，4℃条件下离心10 min，取上清液过 0.22 μm滤膜。对于血浆样本，取 0.5 mL血浆，加入1 mL甲醇以沉淀除蛋白，均质 1 min后置于 5000 g，4℃条件下离心 15 min，取上清液过0.22 μm滤膜。尿液和血浆样本的进样量均为 2μL。
4 非靶向代谢组学分析
5 靶向代谢组学分析
表1 HRAM-MS选择离子监测模式下的靶向代谢物
6 方法学验证
7 统计分析
结果
1 西兰花中每种芥子油苷及其总含量的定量分析
在西兰花中共检测到 10 种芥子油苷，总含量为14.67 μmol/g干重。本研究不以菜籽油作为对照样品，而是使用高分辨质谱对脱硫芥子油苷进行确证。m/z 195.03（C6H11O5S）子离子碎片是硫代葡萄糖基团特征离子碎片，用于确认脱硫形式的芥子油苷。之前的一项西兰花饲喂研究探究了萝卜硫苷（4-甲基亚磺酰基丁基硫苷）代谢物，如 SFN 及其相关的轭合物等。然而，除了芸薹葡糖硫苷（吲哚-3-亚甲基芥子油苷，3.15 μmol/g干重）外，并未发现其他吲哚族芥子油苷相关的代谢物。其他主要的吲哚族芥子油苷是新葡萄糖芸薹素（1-甲氧吲哚-3-亚甲基芥子油苷，4.98 μmol/g干重）和4-甲氧基-芸薹葡糖硫苷（0.44 μmol/g干重）。这两种甲氧基芸薹葡糖硫苷占芥子油苷的37%，所以研究这些西兰花摄入后的甲氧基芸薹葡糖硫苷代谢物是十分必要的。
2 尿液样品的非靶向代谢组学分析
在非靶向代谢组学分析中，为尽量降低仪器变化造成的影响，样品采集的顺序是随机的。QC 样品中的这些主要离子特征偏差小于15%。根据保留时间偏差确定色谱图的重现性。整体保留时间偏差小于 0.2 min。基于此，从不同参与者采集的样品之间的差异能够更大程度反映出代谢产物的变化。QC 样品的多元统计分析结果显示，系统偏差在允许范围内，各组之间代谢物轮廓的差异是由于实验设计中的因素引起的。
通过主成分分析（PCA）模型可以判别相似度高的样品簇、分析变化趋势及找出离群值。数据经Progenesis QI软件处理后，在正离子模式下共检测到 3761 个代谢物。将每一种特征离子的丰度进行归一化处理，然后采用pareto方法进行缩放。使用这种处理方法发现，在不同时间段内采集的样品并没有明显的区别开。如图1所示，在PCA模型中，四次重复进样的样品并没有明显区分开。这些结果表明，差异主要是由于在参与者对西兰花饮食干预的响应引起的。因此，将数据重新进行分组和检验。
如图1（B）所示，在PCA模型中看到不同时间点采集的样品之间出现了明显的分组。还发现，由于聚类趋势不同，不同个体对西兰花摄入具有不同的代谢轨迹（个体差异及个体内部不同响应之间的差异）。尿液代谢轮廓的个体差异较大，这表明对不同参与者体内的代谢物变化进行比较分析将会提供更多有价值的信息。
载荷图用于寻找引起组间差异的重要的离子。根据第一主成分或第二主成分载荷系数绝对值大于0.1，共确定出19种重要的离子（见图1C中的红色方块标记）。其中，通过搜索Metlin、HMDB和PubChem数据库初步确定了7种离子，具体见表2。在载荷图中，值得注意的是，西兰花摄入后，马尿酸（5.95_179.0582n）的载荷值最高，并且在摄入西兰花的参与者体内变化趋势相似。对照组（0 h）中的马尿酸水平最高，西兰花摄入后其浓度出现下降并在摄入2～4 h后水平达到最低，有一名参与者的马尿酸水平在摄入4～6 h后达到最低，然后出现上升（一直升至24 h）。流行病学研究显示，马尿酸与健康儿童和青少年群体摄入水果和蔬菜有关。随着水果和蔬菜摄入量的增加，马尿酸的水平升高。有研究显示，膳食中的类黄酮与尿液中马尿酸的排泄有关。然而，这些研究是使用三天称重的饮食记录而不是控制饮食进行的，而且也没有提供水果和蔬菜的详细信息。本研究中，并未观察到西兰花摄入后马尿酸水平增加。除马尿酸外，还检测到其他的内源性尿液代谢物，如肌酐、尿酸和肉碱等。
在非靶向代谢组学研究中，并未发现芥子油苷代谢物出现变化，这可能是因为与其他较高强度的内源代谢物相比，其变化非常小，所以无法与噪音明显的区分开。
表2 尿液样本中重要代谢物离子的初步鉴定结果
图1 6位健康参与者所有尿液样本的主成分分析模型（A）参与者3（B），和参与者3的载荷图（C）。
3 萝卜硫苷和吲哚类芥子油苷代谢物的靶向代谢组学分析
基于全扫描质谱方法的非靶向代谢组学技术的灵敏度达不到分析要求。因此，本研究基于选择离子监测模式下的高分辨质谱技术（HRSIM），开发了一种高灵敏度、高特异性和高精确度的方法。之前的报道仅研究了萝卜硫苷和芸薹葡糖硫苷的代谢物，而并没有包括4-甲氧基芸薹葡糖硫苷和1-甲氧基芸薹葡糖硫苷的代谢物。由于甲氧基芸薹葡糖硫苷也是西兰花中的重要成分（占总芥子油苷的37％），因此在本研究中还考虑了这两种吲哚芥子油苷的代谢产物。
根据代谢物在色谱柱上的保留行为对HRSIM时间条件进行了优化。代谢物的质谱偏差小于1 ppm。
在优化后的最佳实验条件下，SFN、I3C、I3CAL和I3CA在尿液和血浆中均具有良好的线性、灵敏度和可重复性，相关系数均大于0.99。由于没有商业化的参考标准品，所以我们将萝卜硫烷巯基化途径的代谢产物作为萝卜硫素进行定量。分别以吲哚-3-羧酸、吲哚-3-甲醇和吲哚-3-吡咯甲醛为标准品对甲氧基吲哚羧酸、甲氧基吲哚甲醇和甲氧基吲哚吡咯甲醛进行定量。使用吲哚-3-甲醇作为参考标准品对抗坏血酸和甲氧基抗坏血酸进行定量分析。甲氧基吲哚羧酸、甲氧基吲哚甲醇和甲氧基吲哚吡咯甲醛具有几种异构体，用这些异构体的封面及之和进行定量分析。
4 尿液样品中的芥子油苷代谢物
图2中呈现了萝卜硫苷、芸薹葡糖硫苷和甲氧基芸薹葡糖硫苷代谢物的典型选择离子监测模式下的色谱图。共检测到13种代谢物。除空腹时采集的尿液样本（t=0）外，在其他所有的样本中均检测到了来自萝卜硫苷的萝卜硫素（SFN）、萝卜硫素-半胱氨酸（SFN-CYS）、萝卜硫素-N-半胱氨酸（SFN-NAC）和萝卜硫素-谷胱甘肽（SFN-GSH）。在我们的研究中，除了未发现萝卜硫素-半胱氨酸-甘氨酸，其他的结果与之前的报道一致。通过肌酐浓度对其他代谢物浓度进行标准化。除SFN-GSH的浓度在4～6 h达到最高后，SFN及其他的SFN代谢物的平均浓度在2～4 h达到顶峰。SFN在2～4 h内的平均浓度为1197.80 ± 942.43 nmol/mmol，而SFN-GSH的最高浓度（4～6 h）很低，为5.15 ± 1.62 nmol/mmol。在尿液样本中检测到了来自芸薹葡糖硫苷的吲哚-3-甲醇（I3C）、吲哚-3-吡咯甲醛（I3CAL）和吲哚-3-羧酸（I3CA）。值得注意的是，对于I3C，并未发现质子化的[M + H] +，而检测到了[M + H-H2O] +形式的主峰，这一结果与之前的报道一致。
图2 人体尿液中芥子油苷代谢物的HRSIM色谱图
在任何一个尿液样本中都没有检测到吲哚-3-乙腈（I3-CAN）和3，3’-二吲哚甲烷，值得注意的是，即使在研究前要求参与者避免食用芥子油苷，在西兰花摄入之前收集的空腹尿液样品中也观察到了I3C、I3CAL和I3CA。然而，I3-CAL已经在小鼠和人类的尿液中作为内源性代谢物被检出，在代谢通路中，I3C通过氧化反应转化为I3CAL和I3CA。因此，芸薹葡糖硫苷代谢物，尤其是I3-CA 和 I3-CAL可能不是摄入十字花科蔬菜的标志化合物。然而，这些代谢物的含量在摄入西兰花后出现显著上升。在两个参与者的空白尿样中也检测到了抗坏血酸，但其浓度很低，而在2～4 h时，其含量最高（9631.13±6285.15 nmol / mmol）。
根据芸薹葡糖硫苷的吲哚代谢产物的化学结构，可以合理地推断出甲氧基芥子油苷的代谢产物为甲氧基吲哚-3-甲醇（MI3C）、甲氧基吲哚-3-甲醛（MI3CAL）、甲氧基吲哚-3-羧酸（MI3CA）和甲氧基-抗坏血酸（MABG）。与芸薹葡糖硫苷的代谢物类似，这些代谢物的浓度在4～6 h达到峰值，且MABG达到最高浓度（9824.68±7145.73 nmol/mmol）。
本研究首次报道了羟基-ABGs，并且这些代谢物可能来自西兰花中的羟基芥子油苷，或是经ABG的氧化产生的。然而，由于缺少这些化合物的参考标准品，且1-甲氧基-葡糖胺素和4-甲氧基-葡糖胺素产生的代谢物具有相同的元素组成，所以我们无法对其进行区分。这些代谢物在尿液中的浓度见图3。
图3人体尿液中芥子油苷代谢物的浓度
5 血浆样本中的芥子油苷代谢物
SFN、SFN-CYS和SFN-NAC是血浆样品中检测到的三种主要的萝卜硫苷代谢物。浓度在2-4h达到最高水平，但在24 h的浓度低于检出限。血浆中鉴定出的主要芸薹葡糖硫苷的代谢物为I3-CAL、I3-CA和ABG。I3CA是主要代谢产物，其浓度在2 h达到最大值（70.30±9.20 nmol/L）。血浆中检测到的甲氧基芸薹葡糖硫苷代谢物为MI3CA和MABG，峰值浓度分别为32.31±27.98和29.49±8.4 nmol/L。与尿液中的代谢物浓度相比，血浆代谢物浓度较低。同样，参与者之间的个体差异对代谢产物（如甲氧基-吲哚羧酸和SFN-CYS）影响很大。在0 h未检测到ABG或MABG，其浓度在3 h时达到最高。
本研究结果表明，芥子油苷代谢物（SFN、SFN-CYS和SFN-N-CYS）可以作为摄入富含萝卜硫苷和萝卜硫素芸薹属蔬菜的可靠标志物。这些代谢物在对照样品（t=0）中不存在，但却是西兰花摄入后的血浆的主要代谢产物。在对照样品（t=0）中检测到了吲哚代谢产物，例如来自芸薹葡糖硫苷或甲氧基芸薹葡糖硫苷的I3CAL、I3CA或MI3CA，但其浓度在西兰花摄入后升高了3～5倍。ABG或MABG的衍生物，包括4-羟基抗坏血酸、4-甲氧基抗坏血酸和（N-甲氧基衍生物）新抗坏血酸，之前也已在西兰花和羽衣甘蓝等芸苔类蔬菜中报道过。因此，血浆中的ABG或MABG可能不仅来源于与抗坏血酸盐反应的吲哚衍生物（经黑芥子酶介导从吲哚芥子油苷降解而来），而且还可能来源于直接吸收。血浆中代谢物的时间-浓度曲线如图4所示。
图4 摄入200 g未煮熟的西兰花后人体血浆中芥子油苷代谢物的时间-平均浓度曲线
结论
综上所述，采用非靶向代谢组学技术确定的代谢物可以作人体摄入西兰花的生物标志物。尽管参与者之间的反应存在个体差异，但摄入西兰花后，这些代谢物会随时间出现变化。尿液样本中马尿酸水平的降低可能与西兰花的摄入有关。本研究建立了用于芥子油苷代谢物靶标分析的高灵敏度、高分辨率和高准确度的质谱分析方法，并首次报道了源自甲氧基芥子油苷的血浆代谢物。使用该方法可以检测到人体摄入生西兰花后尿液和血浆中nM水平的多种芥子油苷代谢物。
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