科研 | Nature子刊：精神分裂症肠道微生物组特征的宏基因组关联分析(国人作品)
编译：小鹿同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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越来越多的证据表明，肠脑轴在精神疾病中发挥着重要作用，这促进了相关机制的研究，从而为将来进行针对性的干预措施打下基础。未接受过药物治疗的患者的宏基因组数据几乎不会影响研究者对肠道菌群与大脑之间复杂相互作用的综合分析。
本文中研究者分析了90名无药物治疗精神分裂症患者和81名健康对照者的粪便微生物组，确定了一种能够区分患者和对照者的微生物物种分类器。研究者发现与精神分裂症相关的功能性潜能包括短链脂肪酸合成、色氨酸代谢以及神经递质的合成/降解等方面的差异。Streptococcus vestibularis（精神分裂症中比较富集的细菌）的移植会引起小鼠的社交行为缺陷，并改变小鼠外周组织中神经递质的水平。本文为队列研究和动物模型的进一步研究提供了新的线索。
论文ID
原名：Metagenome-wide association of gut microbiome features for schizophrenia
译名：精神分裂症肠道微生物组特征的全基因组关联分析
期刊：Nature Communications
IF：11.880
发表时间：2020.03.31
通信作者：马现仓&贾慧珏&Karsten Kristiansen
通信作者单位：西安交通大学第一附属医院精神科，华大基因，丹麦哥本哈根大学
实验设计
本研究首先对90名无药物治疗精神分裂症患者和81名健康对照者的粪便样本进行了测序和分析，比较了精神分裂症患者和对照之间基因丰度、宏基因组操作分类单元（mOTU）的差异，通过KEGG数据库分析了精神分裂症患者富集的功能模块和途径，从而对精神分裂症患者的肠道菌群进行了概述。其次，研究者在物种水平上对精神分裂症患者和对照之间肠道微生物的神经活性潜能进行了比较，确定其中肠-脑模块（GBM）的丰度差异，并进一步验证了精神分裂症中与色氨酸代谢相关的GBM。接着，研究者通过随机森林模型对肠道的mOTUs进行分析，结合90名患者治疗前后粪便样品的宏基因组数据，表征了精神分裂症患者肠道菌群的物种特征。最后，研究者在小鼠模型中进行S. vestibularis（精神分裂症中富集的细菌）移植实验，对移植后的小鼠进行了行为测试评估，并比较了外周组织和大脑的神经递质水平，从而确定S. vestibularis对精神分裂症行为的影响。
结果
研究者对来自90名无药物治疗患者和81名健康对照者的粪便样本进行了鸟枪法测序，每个样本平均获得11.46千兆碱基（Gb）的序列数据，并将高质量的reads映射到一个全面的参考基因目录，该参考基因目录包含了1,140万个基因。
精神分裂症患者的肠道菌群在菌属水平上表现出较大的α多样性（P = 0.027，Wilcoxon秩和检验），在菌属水平上（P <0.001，Wilcoxon秩和检验）和微生物基因水平上（P <0.001，Wilcoxon秩和检验）表现出较高的β多样性，且与健康对照者相比，精神分裂症患者的肠道菌群中包含更多的基因。在共计360个宏基因组学操作分类单元 （mOTUs）中，有83个mOTUs在患者和对照之间的相对丰度上存在显著差异（P <0.05，错误发现率（FDR）= 0.136，Wilcoxon秩和检验和Storey’s FDR方法）。在调整了BMI、年龄、性别和饮食之后，这83个mOTUs的相对丰度差异仍然很显著。精神分裂症患者的肠道菌群包含许多兼性厌氧菌，如Lactobacillus fermentum、Enterococcus faecium、Alkaliphilus oremlandii和Cronobacter sakazakii/turicensis，它们在健康肠道中很少见。此外，精神分裂症患者口腔中经常存在的细菌，如Veillonella atypica、Veillonella dispar、Bifidobacterium dentium 、Dialister invisus、Lactobacillus oris和Streptococcus salivarius，其丰度要高于对照口腔中的细菌丰度，表明精神分裂症患者的口腔微生物与肠道微生物之间存在密切联系。
研究者接着构建了一个mOTU网络来描述与精神分裂症相关的肠道细菌之间的共现相关性（图1）。精神分裂症患者中富集的mOTUs比对照组内富集的mOTUs更具有相互关联性（斯皮尔曼相关系数<-0.3或>0.3，P<0.05）。Streptococcus菌属和Veillonella菌属的mOTU种类表现出正交叉相关性。此外，这两个相关的mO TUs簇中大多数物种都起源于口腔，再次指明了口腔常驻细菌与肠道细菌之间的关系，这表明口腔常驻细菌以协同作用的方式可能在精神分裂症患者的肠道中定殖（图1）。
使用KEGG数据库分析了患者肠道菌群中与对照相比富集的功能模块和途径。两组之间有579个KEGG模块和323个KEGG途径的相对富集情况存在显著差异。精神分裂症患者缺乏的微生物功能模块包括果胶降解、脂多糖的生物合成、自诱导物2（AI-2）的转运系统、谷氨酸/天冬氨酸的转运系统、β-胡萝卜素的生物合成，而精神分裂症患者中比较丰富的功能模块包括甲烷的生成、γ-氨基丁酸（GABA）的分流以及锰、锌和铁的运输系统。
2 精神分裂症相关细菌的神经活性潜能
接下来，研究者使用Valles-Colomer等人报告的方法，在物种水平上将精神分裂症患者肠道菌群与对照组的微生物神经活性潜力进行了比较。研究者将171个样品的宏基因组学数据映射到一个基因组数据库，该基因组数据库包括使用PanPhlan方法基于83个精神分裂症患者相关mOTUs而检测到的42个微生物种类，并计算了微生物的物种流行率。然后，研究者确定了在每个微生物物种中都存在的56个肠-脑模块（GBM）的丰度在精神分裂症患者和对照之间是否存在显著差异。通过相互检验与GBM相关的基因和物种基因库，可以获得每个微生物物种的GBM集。使用卡方检验比较了患者和对照之间每个物种中每个GBM的发生频率。精神分裂症相关的GBMs包括短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸）的合成、色氨酸的代谢以及几种神经递质（如谷氨酸，GABA和一氧化氮）的合成（图2）。
研究者选择验证精神分裂症患者中与色氨酸代谢相关的GBM的存在，因为色氨酸的代谢受肠道菌群的调节，并与精神分裂症的发病机制有关。因此，在患者和对照中检测了血清中色氨酸的代谢产物，并将其与肠道菌群中色氨酸模块的存在相结合。研究者观察到精神分裂症患者的血清中色氨酸水平较低，犬尿喹啉酸（KYNA）的水平较高，这与色氨酸代谢相关的GBMs含量较高的结果相一致。此外，血清中色氨酸的水平与精神分裂症患者中富集的38个细菌物种的丰度呈负相关，而与对照组中富集的6个细菌物种丰度则呈正相关。同样，血清中KYNA水平与精神分裂症患者体内富集的10个细菌物种丰度呈正相关，而与对照组内富集的3个细菌物种丰度呈负相关。因此，改变的肠道菌群可能与精神分裂症患者血清中色氨酸和KYNA的水平变化有关。
3 精神分裂症患者的肠道微生物物种特征
为了确定与精神分裂症相关的新型肠道细菌物种并评估其诊断价值，研究者首先基于肠道mOTUs构建了一组随机森林模型的疾病分类器。研究者对90名患者和81名健康对照者进行了10次5折交叉验证的程序。在随机森林交叉验证中，有26个肠道mOTUs达到了最低分类误差，且该模型的接受者工作特性曲线（AUC）下面积为0.896（图3a，b）。这种基于微生物的分类器不受年龄、性别、BMI和饮食方式的影响。这种具有分类能力的模型在另一个队列中得到检验，其中该验证队列由45名服用抗精神病药物的患者和45名健康对照者组成。该模型在AUC为0.765的情况下仍能将患者与对照区分开。在该分类器包括的26个mOTUs中，有11个具有分类学特性的细菌物种在精神分裂症患者中显著富集，即Akkermansia muciniphila、Bacteroides plebeius、Veillonella parvula、Clostridium symbiosum、Eubacterium siraeum、Cronobacter sakazakii/turicensis、S. vestibularis、Alkaliphilus oremlandii、Enterococcus faecium、Bifidobacterium longum和Bifidobacterium adolescentis。这其中的一些微生物与症状的严重程度、认知能力和诊断情况显著相关（图3c）。
研究者接着对来自90名患者治疗3个月后的38例粪便样本中进行了宏基因组学分析。精神病症状和认知障碍随着治疗而大大改善。但是，治疗之后大约只有一半的mOTUs（能够区分患者和对照）恢复到了对照的水平（图3d）。随着随访患者样本量的减少，统计学显著性的阈值从0.05增加到0.1。在鉴定出的26种微生物中，有20个物种在81名健康对照者和38名基线患者之间仍存在显著变化（P <0.1，FDR = 0.44，Benjamini & Hochberg方法，图3d）。经过3个月的治疗后，与81个对照相比，这26个mOTUs中有12个的丰度仍显著改变（P <0.1，FDR = 0.33，Benjamini & Hochberg方法）。在随访患者中就治疗效果对所有肠道mOTUs进行成对比较，结果显示有48个细菌物种的丰度存在差异（P <0.05和FDR = 0.420，成对的Wilcoxon秩和检验；Benjamini & Hochberg方法）。但是，26个mOTUs的精神分裂症分类器中仅包含48种差异性优势种中的5种。该结果表明抗精神病药物的治疗会影响肠道菌群，但并不能完全恢复因精神分裂症而改变的菌群。
4 S. vestibularis引发小鼠产生类精神分裂症的行为
S. vestibularis有助于研究者将患者与健康对照者区分开，并与血清中的GABA、色氨酸、KYNA以及MATRICS Consensus CognitiveBattery (MCCB)测试中精神分裂症认知简要评估（BACS）的评分相关（图3）。此外，研究者预测存在于许多精神分裂症患者肠道中的S. vestibularis具有与谷氨酸合成、GABA降解和异戊酸合成相关的GBMs（图2）。由于已知S. vestibularis的某些致病物种能够进入大脑，并与小儿急性发作神经精神病综合症相关，因此研究者提出：S. vestibularis是否可能在精神分裂症的病理生理中起作用。因此，研究者使用抗生素将小鼠肠道微生物群清除后，通过口腔管饲饮用水的方式将S. vestibularisATCC 49124移植到C57BL/6小鼠体内。广泛存在于人类肠道中的另一种链球菌——S. thermophilus ST12作为阴性对照细菌。对小鼠进行行为测验以评估S. vestibularis移植的作用（图4a）。定量聚合酶链式反应（q-PCR）用来量化S. vestibularis和S. thermophilus的16S rRNA基因，发现它们的浓度在细菌移植后分别立即增加了4,164倍和6,183倍，并且在行为测试后，与空白对照小鼠相比分别保持着31.2倍和58.1倍的增加。与使用生理盐水管饲或S. thermophilus管饲的对照组小鼠相比，经S. vestibularis处理后的小鼠在一个30分钟旷场实验中表现出总行进距离和后肢站立次数的增加（图4b，d）。它们在10分钟的适应期后继续进行着快速移动，且在30分钟内其运动活动并没有明显下降（图4c）。在交际测试中，S. vestibularis小鼠的社交能力和社交新奇性明显不足，因为它们的社交能力要差得多，从而避免了社交新奇性（图4e-g）。但是，在巴恩斯迷宫、高架十字迷宫和悬尾试验中， S. vestibularis小鼠表现出的空间记忆能力、抑郁状态和焦虑水平类似于生理盐水或S. thermophilus处理的小鼠状态。S. vestibularis处理小鼠、S. thermophilus处理小鼠和空白对照小鼠的体重、系统促炎性细胞因子、内毒素和HPA轴激素都没有出现显著变化。
然后，研究者比较了经S.vestibularis处理和生理盐水处理的小鼠在外周组织和大脑等部位的神经递质水平。经S.vestibularis处理的小鼠血清、肠内容物和结肠组织中的多巴胺水平立即显著降低，且肠内容物中的GABA水平也立刻降低了，但这些影响在移植后10天就消失了。在整个行为测试中，经S. vestibularis处理的小鼠肠内容物表现出5-HT水平的升高。与生理盐水处理的小鼠相比，小鼠移植S. vestibularis并未引起明显的炎性细胞浸润，但诱导了肠道中许多免疫/炎症相关基因的表达变化。通过基因富集分析，研究者发现这些基因在细胞因子-细胞因子受体的相互作用、趋化因子的信号传导途径、白细胞的跨内皮迁移、补体和凝血级联的信号传导、抗原的加工和呈递、生产IgA的肠道免疫网络和炎性肠病等过程中富集。这些结果表明S. vestibularis可能影响肠道的免疫稳态。大脑中神经递质的水平不受S. vestibularis移植的影响，只有色氨酸在经S. vestibularis处理小鼠的前额叶皮层中有所减少。但是，研究者在S. vestibularis处理小鼠和生理盐水处理小鼠的前额叶皮层（PFC）、纹状体和海马中分别观察到354、540和470个显著差异表达的基因。受这些差异表达基因影响的途径包括防御反应和免疫调节途径（这与在肠道中观察到的差异表达基因十分类似），以及过氧化物酶体增殖物激活受体的信号传导途径、类固醇的生物合成、酪氨酸和色氨酸的代谢。
讨论
评论
精神分裂症是一种严重的精神疾病，与幻觉、妄想和思想障碍相关，会扰乱感知能力和社交行为。目前其病因尚未阐明，但在精神分裂症中炎症的重要性和肠胃系统的参与引起了研究者们的关注。肠道菌群在神经发生过程中起着重要作用，微生物群和微生物产物已被证明可以干扰行为。
本文中研究者使用171个样本进行了一项宏基因组关联分析，并通过另外90个样本对分析结果进行了验证。研究者基于KEGG数据库以及粪便样本宏基因组的肠-脑模块（GBM）对精神分裂症肠道菌群的功能性变化特征进行了分析。通过对小鼠移植S. vestibularis，并观察其对小鼠行为和脑神经化学物质的影响，从而探索S. vestibularis的可能作用。本研究首次确定与精神分裂症相关的S. vestibularis细菌在疾病发病过程中的功能性作用，使其成为将来治疗精神分裂症的潜在靶标。
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