科研 | Front. Pharmacol.：黄芪多糖改善高脂饮食诱导代谢紊乱的宏基因组和代谢组学分析（国人作品）
编译：逍遥君，编辑：小菌菌、江舜尧。
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大多数草药多糖对代谢紊乱，如非酒精性脂肪肝和肥胖有多重益处。然而，其潜在作用机制在很大程度上尚不清楚。研究人员主要通过对雄性C57BL/6J小鼠饲喂含或不含黄芪多糖的高脂饲料，并分别通过宏基因组测序和非靶标代谢组学研究肠道微生物谱和代谢物谱。研究发现，黄芪多糖能有效缓解高脂饮食诱导的代谢紊乱，改变肠道菌群组成和功能。高脂饮食处理后代谢产物及肠道细菌发生显著变化，但随着黄芪多糖的摄入这些变化均被逆转，其中包括主要来自Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutes和Proteobacteria门的188株细菌和36种代谢产物发生了显著的变化。此外，通过宏基因组功能注释分析和代谢产物富集通路分析，确定了谷胱甘肽代谢和嘌呤代谢途径的改变，并且肠道微生物的变化与肠道关键代谢产物的变化有关。本研究共发现31种和20种肠道细菌分别与嘌呤代谢和谷胱甘肽代谢相关。综上所述，该研究结果显示，在高脂饮食喂养和黄芪多糖干预后，实验动物的宏基因组和代谢组发生了显著变化，揭示了肠道微生物和代谢产物之间的潜在相关性，并强调了草药多糖通过调节肠道微生物群，进而改变宿主代谢，改善代谢紊乱。本研究对中草药的深度利用及开发、抑制肥胖的潜在机制提供了理论基础。
论文ID
原名：Integrated metagenomic and metabolomic analyses of the effect of Astragalus polysaccharides on alleviating high-fat diet–induced metabolic disorders
译名：黄芪多糖改善高脂饮食诱导代谢紊乱的宏基因组和代谢组学分析
期刊：Frontiers in Pharmacology
IF：4.225
发表时间：2020.06
通讯作者：李后开&盛莉莉
作者单位：上海中医药大学实验室
实验设计
结果
1 黄芪多糖可减轻高脂饮食诱导的代谢紊乱
为探究黄芪多糖对代谢紊乱的改善作用，4周龄小鼠分别饲喂对照低脂饲粮、高脂饲粮（增补或未增补黄芪多糖）14周。长期的高脂饮食显著增加了小鼠的体重、肝脏重量、脂肪肝变性（H&E染色），然而，当小鼠增补黄芪多糖后，上述指标均被显著逆转（图1A-D）。此外，黄芪多糖处理后显著降低血清中总胆固醇、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、空腹血糖和胰岛素水平，上述指标在未处理组显著增加（图1E-I）。这些结果表明黄芪多糖对高脂饮食诱导的小鼠代谢紊乱有一定的抑制作用。
图1 黄芪多糖减轻高脂喂养小鼠的肝脏脂肪变性。雄性C57BL/6J小鼠（4周龄）分别用对照低脂饲料或高脂饲料，加或不加黄芪多糖（高脂饲料中含8%的黄芪多糖）治疗14周。（n=5）（A）体重。（B）肝脏重量。（C）肝脂肪变性评分。（D）肝组织的H&E染色切片（放大倍率，×200，50 mm）。（E）血清总胆固醇水平。（F）血清丙氨酸转氨酶水平。（G）血清天冬氨酸转氨酶水平。（H）空腹血糖水平。（I）空腹血胰岛素水平。
2 黄芪多糖逆转高脂饮食诱导小鼠的肠道失调
由于植物源性多糖大多不可吸收，因而研究人员猜测黄芪多糖的作用可能与肠道微生物群的调节有关，并收集了盲肠内容物，用于宏基因组检测。每个样本的平均读数为92.8±1.5×107条序列；高脂模型组的Shannon指数显著降低，而黄芪多糖处理后该指数上升，表明黄芪多糖能显著增加微生物多样性（图2A）。基于Bray Curtis距离算法的主坐标分析可显著区分三组，这与层次聚类热图结果一致（图2B,C）。此外，对丰度最高的前9个门分析表明，高脂饮食显著增加了Firmicutes、Deferribacteres和Synergistetes三个菌门的相对丰度，显著降低了Bacteroidetes的相对丰度，而黄芪多糖处理后逆转了上述变化（图2D）。
为了找到可能介导黄芪多糖代谢有益物质的特定细菌，研究人员在种水平上采用宏基因组学分析了数据。对物种进行了注释后，对照组共有8323个物种，高脂模型组小鼠只有7572个物种。与高脂模型组物种数量减少不同，黄芪多糖处理使物种数量增加到了7972（图2E）。采用Fold Change≥2（或≤0.5）和P＜0.01双重标准筛选出188种物种，这些物种在高脂饮食处理后显著改变，但这些改变被黄芪多糖逆转。差异种主要来自Actinobacteria、Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes。其中高脂模型组74种菌种丰度减少，主要来自Bacteroidetes，黄芪多糖处理后逆转；其余114种则相反，主要来自Actinobacteria、Firmicutes、Proteobacteria（图2F）。这些数据表明黄芪多糖在调节肠道菌群组成中起着重要作用，黄芪多糖的摄入可有效地逆转高脂饮食诱导的代谢紊乱，因而肠道菌群的变化有可能与其改善代谢紊乱有关。
图2 黄芪多糖逆转高脂饮食诱导的小鼠肠道失调。对对照组、高脂模型组和黄芪多糖处理组的盲肠样本进行宏基因组学分析。（n=3）（A）Shannon指数。（B）基于Bray-curtis的主坐标分析，然后进行置换多元方差分析（PERMANOVA，R2:0.695，p值：0.005，p.adjust:0.005）。（C）基于Bray-curtis的距离矩阵。（D）丰度前9个门的组间差异分析。（E）维恩图显示了三组样品中肠道微生物群落的物种重叠和物种数量。（F）从188种不同物种推断的共现网络，高脂模型组与对照组相比有显著变化，黄芪多糖组恢复。（红边，Spearman秩相关系数>0.8，p<0.01；蓝边，Spearman秩相关系数<-0.8，p<0.01。）
3 黄芪多糖改善高脂饮食诱导的小鼠肠内微生物的代谢功能
肠道微生物群落结构的变化往往伴随着肠道微生物功能的变化。因此，研究人员进一步研究了补充黄芪多糖后微生物功能的变化。基于KEGG通路分析的Bray-Curtis主坐标分析显示多组间差异明显，黄芪多糖处理组聚在对照组和高脂模型组之间（图3A）。在KEGG水平1上，代谢、环境、细胞周期和人类疾病是最主要的差异途径。其中，代谢所占比例最高（图3B）。研究人员进一步研究了KEGG三级代谢通路。通过LEfSe分析，以LDA>2为标准筛选出27条差异代谢通路（图3C）。其中，高脂饮食激活了6条代谢通路，黄芪多糖可显著逆转这些代谢途径，包括色氨酸代谢、甲烷代谢、硫代谢、昆虫激素合成、柠檬烯和蒎烯降解、硝基甲苯降解。同时，高脂饮食抑制了8条代谢途径，而黄芪多糖显著逆转，包括牛磺酸和亚牛磺酸代谢、阿卡波糖和缬霉素生物合成、异喹啉生物碱生物合成、链霉素生物合成、托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、聚酮糖单体生物合成和N-异戊烯腺嘌呤生物合成（图3C）。此外，谷胱甘肽代谢被高脂饮食激活，并趋向于被黄芪多糖逆转（p=0.07），而嘌呤代谢被高脂饮食显著抑制，而黄芪多糖具有激活的趋势（p=0.07）。总之，通过补充黄芪多糖可部分逆转高脂饮食引起的细菌代谢功能。
图3 黄芪多糖调节高脂饮食喂养小鼠的肠道微生物功能。（A）基于KEGG通路Bray-curtis的主坐标分析，然后进行置换多元方差分析（PERMANOVA，R2:0.745，p值：0.002，p.adjust:0.002）。（B）1级KEGG通路的多组间差异分析。*p<0.05，**p<0.01。（C）用LEfSe分析了三组动物在代谢水平3的肠道微生物功能。以LDA>2为标准的代谢途径相对丰度热图。黑点代表三组间差异显著（p<0.05）。
4 黄芪多糖逆转高脂饮食喂养小鼠的代谢变化
为阐明黄芪多糖的代谢特征，对粪便样本进行了基于LC/MS的阳性和阴性非靶向代谢谱分析。非监督主成分分析是为了显示样本之间的差异，它显示了组间在正模式和负模式下的明显分离（图4A,B）。根据VIP>1（多变量统计分析）和p<0.05（单变量统计）的标准，36种代谢物被高脂饮食显著改变，并被黄芪多糖逆转（图4C）。接下来研究人员对36种差异代谢产物进行代谢途径分析。前5的代谢通路包括9种差异代谢产物，包括脱氧鸟苷、鸟苷、尿嘧啶、肌苷、焦谷氨酸、谷氨酸、麦芽糖、葡萄糖和泛碱，分别是淀粉和蔗糖代谢、新霉素、卡那霉素和庆大霉素生物合成、泛酸和辅酶A生物合成，谷胱甘肽代谢和嘌呤代谢（图4D）。值得注意的是，谷胱甘肽代谢和嘌呤代谢途径是根据细菌功能而改变。上述结果表明黄芪多糖能有效逆转高脂饮食诱导的代谢失调，这与其调节肠道菌群组成有关。
图4 黄芪多糖对高脂饮食喂养小鼠粪便代谢的影响。对粪便样品（n=5）进行基于LC/MS的阳性和阴性模式的无靶向代谢谱分析。（A,B）对照组、高脂模型组和黄芪多糖处理组间SIMCA阳性衍生和阴性衍生的主成分分析。（C）在VIP>1和p<0.05的双重标准下，对照组与高脂模型组、高脂模型组与黄芪多糖处理组的盲肠样品中鉴别出的差异代谢物热图。每列代表一个单独的样本。（D）基于三组代谢产物差异的代谢途径富集气泡图。一个气泡代表一条代谢途径。右边列出了前5条路径。
5 肠道微生物与代谢产物的相关性研究
由于在宏基因组功能分析和代谢产物富集分析中都发现了谷胱甘肽代谢和嘌呤代谢两条重要的代谢途径，因而通过Spearman相关分析，研究人员研究了188种差异细菌与这两种途径相关的5种差异代谢产物的相关性。热图显示出49个物种与4种代谢物显著相关（图5）。相关分析表明，谷胱甘肽代谢的差异代谢产物，包括焦谷氨酸和谷氨酸，分别与14种和8种不同细菌呈负相关，其中Streptococcus_equi和Bizionia_argentinensis与这两种代谢产物呈负相关。此外，嘌呤代谢途径中的鸟苷和肌苷分别与17种和5种差异细菌呈正相关，与7种和2种细菌呈负相关。但嘌呤途径的脱氧鸟苷与任何物种都没有相关性。上述结果表明，某些被黄芪多糖改变的细菌与谷胱甘肽代谢和嘌呤代谢中的代谢产物有关，暗示这些细菌在黄芪多糖的有益作用中起着重要作用。
图5 差异代谢物和差异细菌之间的Spearman相关性。红色立方体表示正相关和蓝色立方体表示负相关。选择Spearman相关系数小于0.7或大于0.7且p<0.01。列出了所选种的门属信息。
讨论
中药多糖对代谢紊乱的有益作用与肠道菌群组成和功能以及代谢产物的改变密切相关。在本研究中，研究人员进行了宏基因组测序和非靶向代谢组学来揭示黄芪多糖对宿主健康的调节机制。宏基因组和代谢组分析显示黄芪多糖部分逆转了高脂饮食诱导的细菌结构和功能以及代谢的改变。研究表明嘌呤代谢途径和谷胱甘肽代谢途径可能在黄芪多糖改善代谢紊乱中发挥重要作用。
肠道菌群的组成已被证明与宿主健康密切相关。本研究数据显示高脂饮食可显著增加Firmicutes的丰度，显著降低Bacteroidetes的丰度，而黄芪多糖可有效地逆转上述变化。大量临床研究表明，非酒精性脂肪肝和肝硬化患者的粪便微生物群中Firmicutes丰度上升、Bacteroidetes丰度下降。Firmicutes的增加会产生更多的脂多糖和脱氧胆酸，这些代谢产物通过肝门静脉进入肝脏，导致肝脏炎症。Bacteroidetes主要分布在肠道远端，参与消化道多糖的发酵，如膳食纤维中的纤维素、半纤维素、β-葡聚糖等短链脂肪酸，可直接激活G蛋白偶联受体，抑制组蛋白脱乙酰基酶作为能量底物，从而调节各种生理过程，可能有助于健康。本研究中，黄芪多糖显著降低了Deferribacteres的丰度。Deferribacteres是一种专性或兼性厌氧菌。Walker A等人通过代谢组学和肠道微生物组学交互分析方法，揭示了与肥胖肠道微生态相关的代谢产物的性质和特异性，并发现C57BL/6J小鼠（不易患肥胖症）和C57BL/6N（易患肥胖症）小鼠的微生物组在Deferribacteres水平上存在显著差异，表明微生物组在肥胖患病概率中起重要作用。
多糖可作为肠道微生物生长的碳源，在大肠内部分或完全发酵。近年来研究发现，多糖干预可能是一种改善糖代谢相关疾病的有效方法，主要通过调节与糖代谢紊乱相关的特定细菌。麦冬多糖可通过增加Lactobacillus的数量，显著改善肥胖小鼠的肠道菌群紊乱。灵芝多糖的摄入减轻了小鼠的肥胖，同时降低了肠道中的Firmicutes与Bacteroidetes的比率，这与本研究结果一致。
肠道菌群通过调节其代谢功能对宿主的健康状况产生巨大影响。在本研究中，基于宏基因组分析，研究人员发现高脂饮食增加了6个细菌代谢，减少了8个细菌代谢，黄芪多糖可逆转这种变化。例如，色氨酸代谢和甲烷代谢被高脂饮食显著富集，而黄芪多糖摄入后则相反。色氨酸代谢对生理和病理非常重要。色氨酸代谢紊乱与肠易激综合征、代谢综合征、肥胖、感染性疾病和神经精神疾病有关。此外，甲烷代谢也与肥胖有关。一些研究表明，产甲烷菌含量与内脏脂肪的百分比呈显著负相关，而且烟酸和烟酰胺代谢途径因高脂饮食摄入而减少，随黄芪多糖摄入则增加。在肥胖的人类受试者中，烟酸摄入量较少与微生物群落α多样性和Bacteroidetes丰度的降低有关。在人体内，肠道靶向缓释烟酸盐可显著增加Bacteroidetes数量，并改善全身胰岛素敏感性和代谢性炎症的生物标志物。本研究目前结果表明，由高脂饮食诱导并被黄芪多糖逆转的差异细菌代谢通路可以解释黄芪多糖在一定程度上对代谢紊乱的改善。
肠道代谢产物是由宿主和肠道微生物共同产生的，在维持宿主健康方面起着至关重要的作用。为了找出参与黄芪多糖发挥抗肥胖活性的差异代谢物，研究人员利用盲肠样本分析了黄芪多糖的代谢谱和代谢途径的变化。淀粉和蔗糖代谢途径中含有葡萄糖和麦芽糖两种差异代谢产物，其富集倍数最高。大量研究表明，长期喂养高脂饮食会导致血糖稳态失调和胰岛素抵抗，本研究结果证实黄芪多糖可使高脂饮食诱导的小鼠空腹血糖和胰岛素水平正常化。此外，在宏基因组功能注释分析中，高脂饮食抑制嘌呤代谢和促进谷胱甘肽代谢，黄芪多糖的摄入具有逆转趋势。同时，根据代谢产物富集通路分析，嘌呤代谢和谷胱甘肽代谢也发生了显著变化。三种差异代谢物脱氧鸟苷、鸟苷和肌苷来自嘌呤代谢途径。嘌呤代谢异常常导致严重的生理和病理后果，嘌呤代谢途径参与多种炎症反应，其最终产物尿酸与胰岛素抵抗、肥胖、非酒精性脂肪肝、慢性肾脏疾病等一系列代谢紊乱。此外，本研究发现不同细菌与这三种代谢物的相互关系没有重叠，表明这细菌可能参与了嘌呤代谢途径的不同阶段。谷胱甘肽代谢途径中包括两种差异代谢产物焦谷氨酸和谷氨酸，这两种代谢产物水平被高脂饮食改变并被黄芪多糖逆转。谷胱甘肽在保护细胞免受氧化损伤和外源性电泳剂毒性以及维持氧化还原平衡方面起着重要作用。谷氨酸和焦谷氨酸是谷胱甘肽代谢的中间产物。谷氨酸和焦谷氨酸水平升高与谷胱甘肽代谢受阻有关。本研究数据表明，黄芪多糖降低了这两种代谢产物，这两种代谢产物的含量随着高脂饮食摄入量的增加而增加，这表明黄芪多糖对谷胱甘肽代谢的正常进行具有保护作用。此外，还发现Streptococcus_equi和Bizionia_argentinensis等20种细菌与谷氨酸和焦谷氨酸含量呈负相关，表明这些细菌可能参与了黄芪多糖改善谷胱甘肽代谢的作用。
综上所述，本研究已有数据表明黄芪多糖通过调节肠道代谢以及肠道微生物结构和功能，对逆转高脂饮食诱导的代谢紊乱具有有益作用。小鼠摄入黄芪多糖后肠道微生物的变化与盲肠代谢产物的变化有关。此外，在宏基因组功能注释分析和代谢产物途径富集分析中都发现了嘌呤代谢和谷胱甘肽代谢，表明这两种代谢途径在黄芪多糖相关代谢紊乱改善中发挥重要作用。综上所述，本研究为黄芪多糖在肠道菌群和代谢水平上治疗高脂饮食诱导的代谢紊乱的潜在机制提供了新的证据。
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