科研 | SR：成人和儿童口腔中产亚硝酸盐的微生物群 / 四六文摘

编译：依然，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

最近，有人提出在口腔细菌中，由NO₃₋产生的亚硝酸盐(NO₂₋)可能有助于口腔健康。本文作者通过采集牙菌斑和舌苔样品，测定NO₂₋产生活性，旨在阐明口腔生物膜上NO₂⁻产生规律。

作者使用含Griess试剂的琼脂覆盖法和分子生物学法鉴定了产生NO₂⁻的细菌群体的组成，发现每毫克湿重产生的NO₂⁻在个体之间存在差异，但在牙菌斑中较高。此外，除在成年人的牙菌斑中，厌氧菌显示出更多的产生NO₂^-的细菌。产生NO₂^-的细菌的比例在个体之间也有所不同，但NO₂⁻的活性和产NO₂^-的细菌的数量之间呈正相关关系，尤其是在牙菌斑中。产生NO₂⁻的细菌主要为放线菌、沙氏菌、细根霉和奈瑟菌。此外，在儿童的舌苔中特异性检测到Rothia。这些结果表明，牙菌斑具有较高的NO₂₋生成活性，而这种活性并不取决于特定细菌的存在或细菌组成，而是取决于产生NO₂₋的细菌的数量。

论文ID

原名：Nitrite‑producing oral microbiome in adults and children

译名：成人和儿童口腔中产亚硝酸盐的微生物群

期刊：Scientific Reports

IF：3.998

发表时间：2020.10

通讯作者：Jumpei Washio

通讯作者单位：日本东北大学牙科研究生院

实验设计

11位成人和11位儿童，分别采集牙菌斑和舌苔刮物，进行活性检测。同时采用含Griess试剂的琼脂覆盖法和分子生物学法鉴定了两类样品中产生NO₂−的细菌群体的组成。

结果

1 在牙菌斑和舌膜中检测到产生NO₂^-的活性

图1展示每个样品的NO₂⁻产生活性(每毫克湿重)(图1a)。尽管个体间差异很大，成人和儿童的NO₂⁻平均生成值没有显著差异。成人和儿童牙菌斑中NO₂⁻生成活性均显著高于舌苔(p = 0.017，p < 0.001)。每个样品的每单位细胞数的NO₂⁻产生活性展示在图1b。同样，尽管个体间差异很大成年人和儿童的NO₂^-平均生成值没有显著差异，。然而，牙菌斑的NO₂⁻生成活性明显高于儿童的舌苔(p =0.002)。

图1.(a)牙菌斑和舌尖涂层样品产生NO₂⁻的活性(pmol/mg湿重)。(b)牙菌斑和舌苔样品(pmol/1×10⁵细胞)产生NO₂⁻的活性。受试者人数:1^-11人(成人)，12-22人(儿童);*差异有统计学意义(p< 0.05)。$:无法提供，因为样品的湿重低于可检测限度。

2 牙菌斑和舌苔中产生NO₂⁻的细菌的数量和百分比

牙菌斑和舌苔样品在需氧和厌氧条件下在琼脂平板上培养，使用琼脂覆盖培养方法(图3)测定NO₂^-产生菌和非NO₂⁻产生菌的数量和百分比(图2)。在成人和儿童中，以及在有氧和无氧条件下，牙菌斑样品中产生NO₂⁻的细菌数量(每毫克湿重)高于舌苔样品。除成人牙菌斑样本外，厌氧培养物中NO₂⁻产生菌的百分比高于需氧培养物(图2)。然而，再次注意到个体间的巨大差异，并且NO₂⁻产生菌的百分比和口腔临床检查参数之间没有相关性。

图2 在好氧和厌氧条件下培养的牙菌斑和舌膜样品中检测到的产生NO₂⁻和非产生NO₂⁻的细菌数(CFU/mg样品湿重)。受试者人数:1^-11人(成人)，12-22人(儿童);好氧:血琼脂板上细菌需氧培养;厌氧:血琼脂板上细菌厌氧培养;*差异有统计学意义(p < 0.05);a:由于样品的湿重低于可检出限度，所以无法提供。

图3 含Griess试剂的琼脂覆盖法检测NO₂⁻产生菌

3 牙菌斑和舌苔中NO₂⁻产生活性与NO₂⁻产生菌数量的相关性

在成人和儿童中，NO₂⁻产生活性和牙菌斑中NO₂⁻产生细菌的数量(需氧培养物的数量、厌氧培养物的数量和培养物的总数量)之间的相关性是显著的(r = 0.61-0.90，p < 0.05)(图4)。此外，儿童舌苔的这些参数之间存在显著相关性(r = 0.81，p < 0.05)，而成人舌苔的这些参数之间不存在显著相关性(图4)。

图4 成年人和儿童牙菌斑和舌苔样本中NO₂⁻产生活性和NO₂⁻产生细菌数量(有氧、无氧和有氧加无氧条件)之间的相关性。两个轴都以对数刻度显示。r相关系数，需氧血琼脂平板上的细菌需氧培养，厌氧血琼脂平板上的细菌厌氧培养。

4 NO₂⁻产生菌的鉴定

图5显示了确定的产生NO2−的细菌的比例。在成人和儿童中，放线菌、沙利亚氏菌和奈瑟氏菌在有氧条件下占NO2−产生菌的大部分，而放线菌、沙利亚氏菌和韦洛内拉氏菌在无氧条件下占NO2−产生菌的大部分。放线菌属主要在牙菌斑中检测到，而不是在舌苔中，检测到的最常见的物种是内氏放线菌、口氏放线菌和约翰逊放线菌(表1)。另一方面，夏里亚属在舌苔中检出率较高。奈瑟氏球菌属主要在有氧条件下发现，牙菌斑和舌苔样本中奈瑟氏球菌的出现频率没有差异。Veillonella属仅在厌氧条件下发现，牙菌斑样品中最常见的种为细小弧菌，舌苔样品中最常见的种为细小弧菌，其次为异型弧菌和细小弧菌(表1)。成人样本的特征是舌苔中奈瑟氏球菌的比例高，而儿童样本的特征是在舌苔中检测到的需氧细菌中罗夏氏菌的比例高，厌氧菌中韦氏菌的比例高。此外，伯克霍尔德氏菌(副伯克霍尔德氏菌)、硒单胞菌和假丙酸杆菌在成人中基本上没有，而在儿童中相对常见。

图5 成人和儿童牙菌斑和舌苔样本中确定的产生NO₂⁻的细菌属的比例

表1 成人和儿童牙菌斑和舌苔样本中NO₂⁻产生菌的数量和比例。粗体值表示每个细菌属的总数。*括号中的值是总百分比。a仅检测过一次的细菌，包括聚集杆菌、表皮葡萄球菌、腔隙莫拉氏菌、霍夫斯塔德钩端螺旋体、摩根球盖菌、短弯曲杆菌、梅氏拉克氏菌和脑莫罗球菌。

讨论

1 改良的含Griess试剂的琼脂覆盖法

使用含有Griess试剂的琼脂覆盖法，作者能够目视检测NO₂⁻产生菌的菌落(图3)。在施用含Griess试剂的琼脂后约20分钟，观察到最强的颜色，此后颜色逐渐趋于褪色。因此，在菌落被琼脂覆盖20分钟后进行观察。使用熔点为30–31℃的低熔点琼脂代替熔点为80–90℃的普通琼脂被，以防止对细菌的热损伤。将乳酸盐添加到覆盖琼脂中，以激活利用乳酸盐的细菌的代谢活性，如韦氏球菌和奈瑟氏球菌。这些修饰可能使作者能够分离出新的NO₂⁻产生菌群，如下所述。

2 在成人和儿童中产NO₂⁻的活性和产生NO₂⁻的细菌数量

目前的研究显示，成人和儿童个体每毫克湿重的样本中NO₂⁻生成活性不同，但总体而言，与舌苔相比，相同湿重的牙菌斑对NO₂⁻生成的贡献更大(图1a)。另一方面，每个样品中每10⁵个细菌细胞的NO₂⁻产生活性在成人和儿童个体中有相似的差异，但是牙菌斑的NO₂⁻产生活性明显高于舌苔的趋势仅在儿童中观察到，而在成人中没有观察到(图1b)。硝酸盐还原菌的细菌组成的个体间差异也可能影响它，尽管需要进一步的研究。NO₂⁻产生菌的数量和百分比也因人而异，但除成人牙菌斑外，厌氧条件下的数量和百分比高于需氧条件下的数量和百分比(图2)，这表明兼性厌氧菌和专性厌氧菌是参与口腔NO₂⁻产生的主要细菌。在成人和儿童的牙菌斑以及一些儿童的舌苔样本中检测到NO₂⁻产生活性和NO₂⁻产生细菌数量之间呈正相关性(图4)。这些结果表明成人和儿童牙菌斑和儿童舌苔的NO₂⁻生成活性基本上由NO₂⁻生成细菌的数量决定。另一方面，成人的舌苔没有检测到显著的相关性。作者认为多种产生亚硝酸盐的细菌，而不是少数有限的细菌，可能有助于口腔中硝酸盐的减少，但作者对口腔中每种细菌的相对硝酸盐减少活性的信息有限。在图4中的一些情况下没有检测到相关性，作者认为需要考虑细菌组成的差异和每个细菌物种的亚硝酸盐产生能力。此外，在最近的一项研究中，维氏菌属物种的过氧化氢产生活性受环境因素如酸碱度、乳酸盐浓度的影响很大。因此，当作者评估口腔中NO₂⁻产生时，应该考虑这些影响。

3 成人和儿童中产生NO₂⁻的细菌种类

Actinomyces在有氧和无氧条件下产生NO₂⁻的细菌中所占比例最大，尤其是在牙菌斑中(图5)。据报道，放线菌是口腔NO₂⁻产生菌的主要类型，本研究支持这一发现。下一个最常见的细菌属是Schaalia, 尤其是 Schaalia odontolytica在舌苔中的检出率更高(表1)。此菌于2018年重新命名为Actinomyces odontolytica。据报道，沙利亚齿解菌也是口腔NO₂^-产生菌的主要类型，如齿解放线菌。另一个最常见的细菌属是eillonella,，特别是在儿童的舌苔中(图5)，这与多埃尔等人(2005年)和海德等人(2014年)的发现一致。Mashima等人(2017年)还报告说，Veillonella是儿童唾液中的一个主要细菌属。本研究支持先前的发现，即Neisseria是成人口腔中主要的NO₂⁻产生菌之一。

此外，这是第一项表明奈瑟氏球菌在儿童中占NO₂⁻产生菌的较高百分比的研究(图5)。然而，在以前的研究中没有检测到奈瑟氏球菌，在以前的研究中，琼脂覆盖法用于检测产生NO₂⁻的细菌。这可能是由于受试者之间的个体差异，但也可能是由于作者使用了低熔点(30^-31℃)的覆盖琼脂。使用这种琼脂可能有助于防止与用熔点为80–90℃的普通琼脂覆盖样品相关的热损伤，尽管奈瑟氏球菌产生NO₂⁻活性的热敏感性尚未得到证实。此外，在本研究中，将乳酸盐添加到覆盖琼脂中可能促进了奈瑟氏球菌以及乳酸盐利用细菌(Veillonella)的NO₂^-产生活性，因为据报道奈瑟氏球菌也利用乳酸盐作为能源。本研究中使用的改良琼脂覆盖法可能更适用于检测产生NO₂⁻的细菌。

Rothia是一种产生NO₂⁻的细菌，发现于口腔。目前的研究表明，罗夏氏菌在儿童舌苔中占NO₂⁻产生菌的高比例(图5)。Mashima等人(2017年)也在儿童口腔中检测到Rothia，尽管他们没有检测NO₂⁻产生活性。Rothia参与儿童舌苔NO₂⁻生成活性的发现是新的，需要进一步研究该属的活性。副伯克霍尔德氏菌是在儿童中检测到的第一种产生NO₂^-的细菌(图5)。有趣的是，Coenye等人报告说，与副伯克霍尔德氏菌密切相关的伯克霍尔德氏菌表现出NO₂⁻产生活性。在本研究中检测到的其他细菌属，链球菌属、嗜囊菌属、硒单胞菌属、血孔菌属、普雷沃氏菌属和埃肯氏菌属，在以前的报告中也被报告为硝酸盐还原阳性，或具有硝酸盐还原的相关基因。据报道，痤疮丙酸杆菌也具有亚硝酸盐还原酶。本研究检测到的假丙酸杆菌属原属于该丙酸杆菌属，因此该属也可能具有硝酸还原酶。与基于宏基因组学的方法相比，基于培养的方法在阐明综合微生物多样性方面存在局限性，并且结果可能受到培养条件差异的影响。目前的数据基本上支持以前在属和种水平上的研究的数据，尽管有一点点差异。这些方法上的因素可能会影响结果，尽管受试者的差异可能会影响它。

4 关于NO₂⁻产生菌及其与口腔健康关系的生态学观点

作者的结果表明，放线菌、沙利亚氏菌和韦洛内拉氏菌是牙菌斑和舌苔中NO₂⁻产生的主要来源。此外，奈瑟氏球菌在成人舌苔中更常见，罗夏氏球菌在儿童舌苔中更常见。放线菌和沙利亚氏菌是兼性厌氧菌，韦洛内拉氏菌是专性厌氧菌，奈瑟氏菌和罗夏氏菌是需氧菌。对所有这些细菌的检测表明，它们分布在在生物膜的不同部位，具有不同的氧浓度，但通过代谢网络共存。细菌从NO₃^-产生NO₂⁻通常由还原力催化，还原力由细菌代谢提供。放线菌和沙利亚能代谢碳水化合物，产生乳酸和还原力，而韦洛内拉能代谢乳酸，乳酸产生还原力，刺激新陈代谢。乳酸也可以由口腔中的大多数糖分解细菌产生，如链球菌和乳酸杆菌。此外，放线菌还能够在有氧条件下利用乳酸，产生还原力，这表明它有可能通过与有氧乳酸代谢相结合的途径产生NO₂⁻。奈瑟氏球菌还已知通过产生还原力的途径利用乳酸盐。然而，关于Rothia的代谢特性的信息有限，需要对该属和本研究中鉴定的其他口服NO₂⁻产生菌进行进一步的代谢研究。在目前的研究中，无法解释成人和儿童之间或个体之间产生NO₂⁻的细菌群体的组成差异，但口腔微生物的代谢特征和网络可能解释了这些差异。但进一步的研究是必要的。NO₂⁻因其抗菌活性和通过改善全身血液循环抑制心血管疾病的能力而受到关注。因此，通过使用NO₂⁻产生菌作为益生菌和/或NO3^-作为益生元，有可能预防口腔疾病(如龋齿和牙周炎)和心血管疾病。此外，NO₂⁻和高铁血红蛋白血症或癌症发病之间的联系尚不清楚，需要进一步研究。

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