编译：微科盟莫沉，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)是以中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质脱髓鞘病变为特点，遗传易感个体与环境因素相互作用的自身免疫性疾病，是中枢神经系统脱髓鞘疾病中最常见的疾病之一。目前，初步的研究表明益生菌在改善MS方面的潜在作用。然而，益生菌对MS的影响尚不清楚。因此，本研究的目的是通过系统性回顾临床前研究(动物模型试验)和随机对照试验的Meta分析来评估益生菌在治疗多发性硬化症的疗效。研究者通过检索PubMed、Web of Science、Cochrane center of randomized clinical trials、EMBASE、clinical trials和Google Scholar，手动筛选截止至2020年11月的信息，共计得到3项合格的随机对照试验(randomized controlledtrials，RCTs)和22项临床前研究。基于接受益生菌治疗的173名MS患者的随机对照试验的Meta分析显示，补充益生菌对患者的心理健康具有显著的有益作用。此外，益生菌的摄入显著改善了患者的胰岛素抵抗以及炎症和氧化应激标记物水平。其中，临床前研究表明，服用益生菌可显著降低MS的发病率及延缓MS的进展(15项研究)，并通过改变免疫和炎症标志物(20项研究)和肠道微生物组组成(4项研究) 改善相关运动障碍(3项研究)改善相关运动障碍(3项研究)。上述结果表明，口服益生菌干预对多发性硬化症的预防和治疗具有一定的有益作用。
原名：Efficacy of probiotics in multiple sclerosis: asystematic review of preclinical trials and meta-analysis of randomized controlled trials
译名：益生菌干预多发性硬化症的疗效: 临床前研究的系统性回顾和基于随机对照试验的Meta分析
期刊：Food & Function
IF：4.171
发表时间：2021.02.03
通讯作者：于雷雷、田丰伟、刘卫
通讯作者单位：江南大学食品学院、食品科学与技术国家重点实验室
在本研究中，从在线数据库中检索得到68条临床试验相关的记录，通过临床试验注册平台和对相关已发表文献的搜索确定了另外的7篇文章(图1)。在去除重复内容之后，仍剩余44篇文章，其中30篇根据标题和摘要被剔除。研究者对14项研究进行了检查，以确定其是否符合全文的条件，其中排除了另外10项研究。最终，研究者纳入了3项针对定性和定量Meta分析研究，文章筛选的详细过程总结在图1中。
对于临床试验分析，纳入本Meta分析的RCTs研究必须满足表1中列出的PICO标准。在这项分析中，受试者人群(population，P)包括接受益生菌干预(intervention，I)的MS患者，并与接受对照或安慰剂的个体进行比较(compared，C)。研究调查的主要结果(outcome，O)是受试者心理健康指数的变化，而次要结果是患者肠道微生物组的组成变化、胰岛素稳态和炎症及氧化应激标志物的变化。基于上述标准，研究者对益生菌干预是否能有效改善MS患者的心理健康和代谢反应进行评估。
关于临床前研究，研究者最初从3个数据库中总共检索出6014篇文章，如图2所示。在删除重复的引文后，剩下5050篇文章。接下来，根据标题和摘要信息，得到有可能符合条件的104篇文章，随后被保留下来。接着，在阅读了45篇候选文献全文后，最终纳入了22篇符合条件的动物模型研究文章，以分析益生菌干预对多发性硬化症的治疗效果。
所有纳入的临床试验均为2017至2020年间在伊朗进行的双盲随机对照试验，评估益生菌对MS患者的疗效。本文共纳入173例患者，并评估了与受试者心理健康有关的标志物，包括炎症反应，氧化应激，代谢生物标志物和营养状况。其中，未发现有评估MS患者肠道微生物组成或补充益生菌干预的先关试验。同时，纳入的研究均未报告对相关不良反应的评估。在所有纳入的研究中，干预时间以及益生菌菌株的选择和剂量也各不相同。表2中列出了所包括的临床研究中益生菌的特征和相关成分。
关于临床前的研究，从2009年2月到2020年1月，在英文期刊上共计发表了22项动物模型相关的研究。表3中总结了纳入的动物模型研究的特点和主要发现。其中，口服益生菌干预平均进行了14至63天。此外，在所有纳入的研究中，益生菌菌株的种类、菌株数量和干预的剂量各不相同。
图3显示了纳入的临床试验中偏倚风险评估的总结分析，有2项研究被评估为低风险。在其中的一项研究中，益生菌干预组患者的病程(7.75±3.99年)高于对照组(5.66年±2.53年；P=0.014)，因此随机序列的产生和分配隐藏域被归类为“some concerns”。对于临床前试验，所纳入的研究(93%)被评估为存在不明确的偏倚风险。同时，仅有30%和25%的动物研究被随机选择用于实验组或对照组和结果评估，这表明选择偏倚和检测偏倚的风险很高。而在另外的两项研究中，在治疗前和治疗后动物的数量都不清楚，尚不清楚存在偏倚的风险。
研究纳入的3项随机对照试验包括进行益生菌干预组的86名受试者和对照组的87名受试者。由于纳入的研究具有高度的异质性(图4a和b)，因此本研究采用随机效应模型进行定量综合。Meta分析的结果显示，益生菌干预组和安慰剂组在改善多发性硬化症患者的心理健康方面存在显著差异(EDSS scores: SMD = -1.22, 95 % CI, -2.40~ -0.03, P = 0.04, I2 = 92 %; BDI total scores: SMD = -1.58; 95 %CI, -3.03 ~ -0.12; P = 0.03; I2= 94 %; GHQ scores: SMD = -0.71; 95 % CI, -1.02 ~ -0.40; P < 0.00001; I2 = 0 %; and DASS scores: SMD = -0.72;95 % CI, -1.12 ~ -0.33; P = 0.0003; I2= 0 %).。随机对照试验的Meta分析的森林图如图4所示。
图4 研究益生菌与安慰剂对多发性硬化症患者心理健康影响的随机对照试验森林图。
df, degrees offreedom,自由度; IV, intervalvariable, 区间变量; SD, standarddeviation, 标准差。同时，该研究采用固定效应模型对胰岛素、胰岛素抵抗的稳态模型评估(homeostaticmodel assessment for insulin resistance，HOMA-IR)、量化胰岛素敏感指数(quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI)的研究数据进行Meta分析。结果显示，益生菌干预组受试者的胰岛素水平明显下降：(MD = -3.36 μIUmL-1; 95 % CI, -4.79 ~ -1.93; P <0.00001; I2 = 49 %), HOMA-IR (MD = -0.73; 95 % CI, -1.12 ~ -0.34; P < 0.0003; I2 = 0 %), andQUICKI (MD = -0.02; 95% CI, 0.01. -0.02; P<0.0001; I2 = 0 %) (图5)。由于各研究对IL-6水平的测定不一致，因此本研究者选择SMD进行IL-6分析。由于纳入的研究具有较高的异质性(图6c和图6e)，因此选择随机效应模型进行NO和GSH的定量合成，选择固定效应模型分析IL-6、hs-CRP、TAC和MDA水平。结果显示，干预组患者IL-6 (SMD = -2.33; 95% CI, -2.81~ -1.84; P<0.000001; I2= 0 %)、hs-CRP (MD = -1.40 µg mL-1;95 % CI, -2.20 ~ -0.59; P=0.0007; I2= 0 %)、NO (MD = 6.79 µmol L-1;95% CI, 1.87 to 11.72; P= 0.007; I2 = 89 %)以及MDA (MD = -0.31µmol L-1; 95% CI, -0.58~ -0.04; P=0.003;I2=0 %) 的水平均显著低于安慰剂组。此外，TAC (MD = 19.18 mmol L-1;95 % CI, 0.34 ~ 38.2; P =0.05; I2= 0 %)和GSH (MD = -14.58 µmol L-1;95 % CI, -91.21 ~ 62.06; P=0.71; I2= 88 %)水平在上述两组之间无显著差异，上述Meta分析结果的森林图如图6所示。
图5 随机对照试验评估益生菌与安慰剂对多发性硬化症患者胰岛素敏感性的影响。
(A)空腹胰岛素；(B)HOMA-IR；(C)QUICKI。HOMA-IR,homeostatic model assessment for insulin resistance, 胰岛素抵抗的稳态模型评估; QUICKI,quantitative insulin sensitivity check index,定量胰岛素敏感性检查指数; df, degreesof freedom,自由度; IV, intervalvariable, 区间变量; SD, standarddeviation, 标准差。
图6 研究益生菌与安慰剂对多发性硬化症患者炎症和氧化应激影响的随机对照试验森林图。
(A)IL-6；(B)hs-CRP；(C)TAC；(D)GSH；(E)MDA；(F)NO。IL-6, interleukin 6,白细胞介素6; hs-CRP, high sensitivity C-reactive protein, 高敏C反应蛋白; TAC, total antioxidant capacity, 总抗氧化能力; GSH, total glutathione, 谷胱甘肽; MDA, malondialdehyde, 丙二醛; NO, nitric oxide, 一氧化氮; df, degrees of freedom, 自由度; IV, interval variable, 区间变量; SD,standard deviation, 标准差。本研究最终纳入22项基于动物模型的临床前研究(表3)。在三个独立的实验中，Kobayashi等人考察了通过给予不同抗原类型的益生菌进行不同时间的干预条件下，益生菌对MS的临床评分及发病率的影响。他们发现，根据临床评分评估，Lactobacilluscasei strain Shirota (LcS)菌株的干预治疗可以降低脑脊髓炎(encephalomyelitis，EAE)的进展，并证实了LcS和Bifidobacterium breve strain Yakult对EAE患者中具有较好的安全性。随后的多项研究进一步证实了益生菌干预可降低EAE患者MS的发生率，使临床症状和脊髓组织学评分正常化。尤其是，每天口服一次Lactibiane Iki的EAE小鼠相比对照组的小鼠具有更好的临床评分，且呈剂量依赖关系。认知障碍和运动障碍是MS的两个主要临床表现。一项研究表明，补充Lactobacillusplantarum 和BifidobacteriumB94不能改善溴化乙锭诱导的髓鞘脱失大鼠的空间记忆和学习障碍。然而，另外两项研究表明，口服八种益生菌(Vivomixx)组成的混合物可以显著改善不同多发性硬化动物模型的运动协调性。LactibianeIki 和Lactobacilluscasei均能改善髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelinoligodendrocyte glycoprotein，MOG)诱导的EAE或环己酮草酰二腙诱导的小鼠脱髓鞘的运动功能障碍。在22篇文章中，有16篇研究了益生菌在MS动物模型中的免疫调节和炎症作用(表3)。最近，Mestre和他的同事们的研究发现，Vivomixx可有效减轻了进展性MS的严重程度，增加了中枢神经系统中的Breg细胞(CD19+ CD5+ CD1dhigh)，同时增加IL-10 mRNA的表达，并降低了脊髓中IL-1β和IL-6基因的表达。有趣的是，Vivomixx干预抑制了感染Theiler鼠脑脊髓炎病毒（Theiler’s murine encephalomyelitis virus，TMEV）的小鼠肠系膜淋巴结中Th17极化的CD4+ T细胞产生的IL-17水平。类似地，Salehiour等人研究发现，口服补充Bifidobacteriumanimalis和L. plantarum的混合物比单独补充菌株更明显地延缓了EAE的进展。从机制上讲，这些益生菌对MS的有益作用可能是通过上调大脑和脾脏中Foxp3和GATA3的表达，抑制Th1和Th17细胞的分化来促进Th2和Treg细胞的分化。此外，研究发现Lactobacillusreuteri可以通过减少Th1/Th17细胞数量和降低IFN-γ/IL-17水平，来减轻EAE的进展。此外，有4项研究探讨了不同益生菌对多发性硬化症动物模型肠道菌群组成的影响。L. reuteri可以选择性地促进与EAE严重程度呈负相关的Bifidobacterium, Prevotella和Lactobacillus菌属的相对丰度，同时降低与EAE临床严重度呈正相关的Anaeroplasma, Rikenellaceae和 Clostridium菌属的丰度。类似地，使用Vivomixx进行干预可以降低Anaerostipes,Dorea, Oscillospira, Enterobacteriaceae以及Ruminococcus的丰度，而增加Bacteroides,Odoribacter, Lactobacillus和Sutterella的丰度，这与TMEV感染小鼠的运动功能显著改善有关。总体而言，上述临床前的动物模型研究表明，使用口服益生菌进行持续干预，可以显著降低MS的进展，并改善相关运动障碍。根据动物研究的初步结果，益生菌可能对免疫应答，炎症反应和肠道微生物的组成结构具有一定调节作用。就目前的临床试验而言，该研究是首个表明接受益生菌干预或安慰剂补充剂患者的心理健康相关参数（EDSS，BDI，GSH和DASS评分）存在显著差异的Meta分析，而上述指标的变化是与MS疾病进展最相关的结局。针对患者生化标记物的影响，本研究验证了宿主代谢情况(胰岛素、HOMA-IR和QUICI)、炎症标记物(IL-6、hs-CRP和NO)和氧化应激相关生物标记物(血浆TAC、GSH和MDA)的改善。然而，从随机对照试验中获得的指标(EDSS评分、BDI评分、血浆NO、GSH)具有高度的异质性，说明上述证据的可信度极低。
MS患者通常患有不同程度的精神障碍，例如运动障碍，麻木，疲劳，头晕，抑郁和焦虑。该研究发现，使用益生菌干预可显著降低MS受试者的EDSS，BDI，GHQ和DASS评分。与本研究的结果相似，最近的一项Meta分析检验了29个RCT，结果发现，益生菌的摄入对抑郁症（d =-0.24，P <0.01）和焦虑症（d = -0.10，P = 0.03）显示出轻微但显著的积极改善作用。尽管目前MS的具体发病机制还不是很清楚，但是越来越多的研究表明，胰岛素抵抗，氧化应激和炎症反应可能在其进展过程中起重要作用。胰岛素抵抗在多发性硬化症患者中十分常见，并且已被证明与多发性硬化症患者的残疾相关。在这篇综述中，研究者发现益生菌的摄入可能通过降低HOMA-IR和增加胰岛素敏感性从而对多发性硬化产生有益的影响。胰岛素抵抗可能与MS中慢性炎症途径和氧化应激相关。在本研究中，研究者发现益生菌可以通过降低IL-6和hs-CRP水平以及增加NO水平来缓解全身炎症反应。同时，该研究发现益生菌的持续摄入可显著降低某些氧化性生物标志物（血浆TAC，GSH和MDA）的水平，这可能与MS患者发病机制有关。
值得注意的是，上述炎症和氧化应激的产生并非局限于MS，而是在多种精神疾病（例如阿尔茨海默病，AD）中起着至关重要的作用。因此，在今后的随机对照试验中应检测更多针对MS的靶向炎症和氧化代谢产物，以探讨益生菌对MS患者保护作用的确切机制。此外，关于多菌种或单菌种对多发性硬化的影响，四项研究评估了多菌种益生菌补充剂对多发性硬化症免疫和炎症参数的影响。相关研究指出，多种益生菌菌株的组合可能比单独使用更有效。已有多项研究指出，与健康个体相比，MS患者的肠道微生物的组发生了显著变化，同时肠道微生物还可以调节MS的风险。近来的研究表明，肠道菌群，免疫系统和大脑之间的双向相互作用与MS的发病机制有关。此外，越来越多的研究表明，肠道菌群的特定菌株可以加重或减轻MS动物模型中的神经炎症。因此，明确益生菌对MS患者肠道微生物组成的影响是十分有必要的。然而，本文中涉及的3个RCT研究并未明确益生菌对MS患者肠道微生物结构的影响以及肠道菌群与免疫系统以及MS中免疫细胞的变化之间的关系。另外3个非RCTs研究证明，益生菌的干预可以影响MS患者的免疫应答和炎症反应。其中的2项研究聚焦于益生菌对患者肠道菌群的影响，发现益生菌的摄入可以选择性降低肠道中Akkermansia和Blautia的相对丰度，而此前有报道称这两种细菌与MS的菌群失调有关，并促进了Lactobacillus, Streptococcus和Bifidobacterium的相对丰度，上述结果表明肠道菌群可能在一定程度上介导了益生菌的有益作用。因此，在今后的临床试验中，应该对肠道微生物的组成和微生物相关代谢产物的变化进行更加全面的检测，以阐明益生菌在MS患者中的作用机理。
大多数的临床前研究都支持益生菌干预的积极作用，包括延缓MS的发生和发展，使EAE的临床和组织学标志正常化，以及减轻相关运动障碍(表3)。从机理上讲，益生菌对多发性硬化的影响可能是通过改善免疫和抗炎反应以及肠道微生物的组成结构来实现的。此外，某些肠道菌群驱动的代谢物水平的升高也可能是益生菌的潜在机制之一。值得注意的是，在接受Vivomixx干预的TMEV小鼠中，研究发现小鼠血浆中丁酸和乙酸的水平增加。据报道，SCFAs产生菌的丰度降低可能是MS的特征之一。研究指出，高纤维饮食或补充SCFAs可以抑制炎症并改善EAE的严重程度。特别是，摄入丙酸(propionic acid，PA)3年可以显著降低每年的复发率，延缓疾病的进展，并改善了脑萎缩。此外，PA还可以一定程度上恢复MS患者体内Treg/TH17细胞比例，逆转了Treg细胞的线粒体功能和形态。越来越多的证据还表明，SCFAs可以通过免疫、内分泌、迷走神经和其他体液途径来直接或间接地影响肠-脑沟通、大脑功能和行为以及精神表现。此外，据报道，Bacteroidesfragilis产生的多糖A (polysaccharideA，PSA)可以改善EAE的严重程度。给予野生型B. fragilis可以预防EAE，而补充缺乏PSA的B. fragilis则并不能预防EAE。此外，PSA还可以通过调节CD39+CD4+ T调节亚群的迁移能力，激活体内CD39+ Foxp3+ T细胞和Treg功能，从而抑制相关神经炎症。因此，今后的研究应更多地关注益生菌对肠道微生物的整体结构和微生物相关代谢产物的影响，以阐明益生菌治疗MS的具体机制。
图7总结了益生菌改善MS的潜在作用机制。(1) 益生菌可以调节MS患者的菌群失调，增加SCFAs产生菌的丰度，同时降低抗炎相关菌种的丰度；(2)益生菌可提高体内SCFAs的水平，降低LPS的水平；(3) SCFAs通过上调紧密连接蛋白如ZO-1和claudin-8的表达，刺激粘蛋白分泌，从而减少LPS和病原体从肠腔进入体循环，维护肠道屏障稳态；(4)益生菌引起的LPS减少可以进一步减少通过ECs、DCs和MQs的不同TLR分泌的炎性细胞因子，从而影响T细胞的增殖和分化；(5)益生菌介导的免疫调节可能归因于某些共生细菌的产物。例如，在肠道中，B. fragilis的PSA被固有层的树突状细胞摄取、加工并呈递给naïve CD4+ T细胞。而激活的TGF-β可诱导抗炎的FOXP3+ Treg细胞的增殖和IL-10的产生，从而抑制炎性Th1和Th17细胞的活性。此外，益生菌还有助于改变肠系膜淋巴结和脾脏中CD4+ Th1/ Th2细胞的稳态，并改变外周和中枢神经系统中效应T细胞亚群的平衡。同样，SCFAs还可降低DCs表面T细胞活化分子的表达，增加结肠Treg细胞的数量和功能，包括FOXP3、TGF-β和IL-10的表达。(6) 降低LPS和促炎性细胞因子，提高SCFAs的水平，增强血脑屏障的完整性；(7)益生菌通过诱导肠内分泌型L细胞分泌GLP-1、PYY等胃肠激素，改善胰岛素抵抗；(8)LPS、促炎细胞因子和单链脂肪酸也可以到达大脑，通过直接或间接作用于小胶质细胞和星形胶质细胞，以减少与神经炎症和脱髓鞘相关的炎症反应。
目前该综述中纳入的研究仍然存在一定的局限性。该研究的Meta分析涉及的3个随机对照试验均没有研究益生菌对MS患者肠道菌群组成、免疫反应相关指标的影响，也没有涉及MS患者外周血和粪便样本中免疫细胞的变化，这些均需要进一步的深入研究。仅有1项研究报告了对饮食摄入的评估，没有其他研究提供或使用这类数据来调整统计分析。饮食摄入量数据可以让我们全面了解饮食和益生菌补充对代谢的影响之间的潜在关联，因为饮食模式或食物成分的变化可以直接影响患者的肠道菌群。此外，根据最近的一项研究，肠道微生物的组成变化还与MS的不同表型有关。因此，益生菌对MS不同表型的干预研究将为今后MS患者精确的饮食干预策略提供依据。不同的研究出现显著的异质性可能是由于不同的治疗方案、剂量、持续时间、中心设置、受试者人群选择和其他因素。同时许多研究都存在明显的偏倚。在很多情况下，只有很少的研究评估了这种效果，因此支持这一结果的证据很少。
SCFA, short-chain fatty acid, 短链脂肪酸; LPS, lipopolysaccharide, 脂多糖; TJPs, tight junction protein, 紧密连接蛋白; T-reg, regulatory T-cell调节性T细胞; TLRs, toll-like receptors, toll样受体; ECs, endothelial cells, 上皮细胞; DCs, dendritic cells,树突细胞; MQs, macrophage cells, 巨噬细胞; PSA, polysaccharide A多糖A; TGF-β, transforming growth factor beta转化生长因子b; FOXP3, forkhead box P3, 叉头样转录因子3; GLP-1, glucagon like peptide-1, 胰高血糖素样肽-1; GIP, gastric inhibitory polypeptide, 胃抑素.图中红色箭头表示MS中的不良改变增加或加重，而绿色箭头表示MS中补充益生菌后的改善作用。在本文中，研究者利用多种检索工具筛选得到了22项临床前的动物模型研究和3项基于RCT的研究，系统地总结了口服益生菌干预对MS的影响。临床前研究的结果表明，口服摄入益生菌对降低MS的发生率和严重程度，延缓病情进展和改善疾病相关的运动障碍具有一定的缓解作用，并可能是通过调节宿主免疫应答和炎性反应标志物以及肠道微生物的组成结构来介导的。与此同时，针对3项基于RCT研究的Meta分析结果表明，持续补充益生菌改善MS患者的心理健康，可能是通过降低炎症和氧化生物标记物水平以及减轻胰岛素抵抗。
