编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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导读
淋巴细胞协调适应性免疫反应，对于建立保护性免疫和维持免疫稳态至关重要。我们对T细胞活化和功能的了解大多来自外周血，但是最新研究表明，大多数人类T细胞位于淋巴、粘膜和屏障组织中，而且T细胞亚群的组成具有组织部位的特异性。因此建立人类健康T细胞状态的基线对于定义疾病中T细胞功能失调和病理功能至关重要。单细胞转录组图谱分析（scRNA-seq）被广泛用于解析多种系统中细胞异质性、发育及激活。本研究利用scRNA-seq分析了来自肺，淋巴结，骨髓和血液的50000多个静息和活化T细胞，用于定义人类血液和组织T细胞的稳态及活化状态，同时利用得到的基线分析人类肿瘤相关的T细胞的scRNA-seq图谱，揭示其功能状态与疾病之间的关系。研究建立的健康的人类T细胞活化的高维参考图为分析T细胞在各种疾病中的组成及功能研究奠定了重要的基础。原名：Single-cell transcriptomics of human T cells reveals tissue and activation signatures in health and disease
译名：人类T细胞的单细胞转录组学揭示了健康和疾病中的组织和激活特征
期刊：Nature communications
IF：11.878
发表时间：2019.10.17
通讯作者：Peter A. Sims
通讯作者单位：美国哥伦比亚大学
DOI号：10.1038/s41467-019-12464-3
从两个健康的已死亡的成年器官供体中分别获得了骨髓（BM）淋巴结、（LN）和肺（LG）作为代表性的原发性淋巴、继发性淋巴和粘膜组织部位。从两名健康的成人志愿者获得血液样本。从组织和血液中分离出的CD3+ T细胞在只有培养基（“静止”）或含有抗CD3/抗CD28抗体的培养基（“激活”）的情况下进行培养（图1a）。取单个细胞合成cDNA，并使用10x Genomics Chromium系统进行条形码编码，然后进行T细胞建库、测序和计算鉴定。由于诸如分子串扰多重捕获和广泛的覆盖范围之类的技术问题，从数据集中彻底删除非T细胞非常复杂。本研究开发了一种程序，通过识别单个细胞和富集了对污染细胞类型高度特异性的列入黑名单的基因表达的细胞簇，来消除造成这些问题的非T细胞。利用统一流形逼近与投影（UMAP,Uniform Manifold Approximation and Projection）进行降维，产生基于各种集群的二维投影，从而分析了不同供体的T细胞粗聚类，比较血液与组织T细胞、TEM细胞。应用了单细胞层次泊松矩阵分解（single-cell Hierarchical Poisson Factorizationsc，HPF）在scRNA-seq数据中发现基因表达特征谱，比较每个组织和供体的活化细胞和静息细胞。其中利用流式细胞仪评估T细胞表面标记的表达、利用实时定量PCR验证关键基因的表达。为了证明验证其使用价值，进一步使用UMAP将四种癌症[非小细胞肺癌（NSCLC）、结肠直肠癌（CRC）、乳腺癌（BC）和黑素瘤（MEL）]的肿瘤相关T细胞的scRNA-seq图谱投影到T细胞活化状态图上。同时还分析了登革热病毒感染患者的T细胞作为验证。首先分析了来自两个供体的组织T细胞群体，发现细胞之间变异的主要来源是激活状态（垂直轴）和CD4/CD8谱系（水平轴）。组织部位也是变异的原因，来自BM和LN的T细胞共定位，而LG的T细胞则不同（图1b），这与LG中CD8+ T细胞和TRM表型细胞相对于其他两个位置的比例更大的现象相符。按照scRNA-seq差异表达基因将T细胞亚群和功能状态按照组织位置和谱系分为10-11个簇（图1c）。CD4+ T细胞包括6-7个簇：静息细胞，表达CCR7、SELL和TCF7（对应于原始细胞或TCM细胞）；3个与激活相关的簇，以不同水平表达IL2、TNF和IL4R；TRM样静止和激活簇，表达标准TRM标记CXCR6和ITGA1；单独的调节性T细胞（Treg）簇，表达Treg定义基因FOXP3、IL2RA和CTLA4（图1c）。CD8+ T细胞包括了4个与CD4+ T细胞不同的簇：2个TEM/TRM样簇：表达CCL5、细胞毒性相关基因（GZMB，GZMK）和TRM标记（CXCR6、ITGA1）；激活的TRM/TEM簇，表达IFNG、CCL4、CCL3；代表最终分化的效应细胞（TEMRA）簇，表达细胞毒性标记物PRF1和NKG7（图1c）。就组织分布而言，TRM主要分布在肺中，Tregs主要分布在LN中，而TEMRA主要分布在BM（与表型分析一致）。其余的静息和活化的CD4+和CD8+ T细胞簇在所有组织位置中存在（图1b，c）。这些结果显示了人体组织中特定子集的特征，但是暗示了跨部位具有相似的的激活特征。
图1.来自多个组织部位的静止和活化T细胞的单细胞RNA-seq分析。a实验工作流程，包括磁珠分选CD3+细胞、体外培养和活化以及Chromium 3'-scRNA-seq。 b来自的两个器官供体CD4的肺（LG），骨髓（BM）和肺引流淋巴结（LN）的静息和活化T细胞合并的scRNA-seq的UMAP降维分群图，着色依据为静止和激活状态、CD4/CD8表达比和组织来源。 c鉴定T细胞亚群。通过表达簇着色的UMAP降维分群图以及利用Z-Score表达的热图显示了T细胞亚群标记基因，差异表达倍数> 2和p <0.05。基因按其富集度最高的簇排序。根据静止状态（“ rest”）或激活状态（“ act”）以及效应记忆T细胞（TEM），组织定居记忆性T细胞（TRM），终末效应记忆T细胞（TEMRA）和调节T细胞（Treg）。进一步研究血液和组织的T细胞的关系，发现大部分血液T细胞与BM的静息或活化T细胞共定位，但与LG或LN的T细胞没有实质性重叠，特别是在静息状态下（图2a，b）。对对静息或活化样本中每个组织中转录类似于CD4+和CD8+ T细胞的血液T细胞的数量进行了量化（图2c，d）。静息血T细胞与BM的CD4+和CD8+ T细胞很相似（图2c，d）。有趣的是，大量未活化的血液T细胞投射到BM中活化的CD4+ T细胞上（图2c，d，左图）。相反，活化的血液T细胞与所有组织部位的活化CD4+ T细胞以及LN的CD8+ T细胞很相似（图2c，d；右图）。这些结果表明静息血液T细胞与BM中最相似，而活化血和组织源性T细胞具有共同的特征。
图2 血液和组织T细胞的比较。a来自组织供体1的T细胞的UMAP降维分群图，覆盖有自两个供血者的静止和活化T细胞组合的UMAP等高线图。b器官供体2，与（a）相同。c热图显示了在组织供体1UMAP中最接近每种组织/刺激状态组合的血液T细胞数量。d组织供体2，与（c）相同。研究是否存在将组织与血液T细胞区分开的基因特征标志，发现与血液相比在各种组织TEM细胞中存在一组相似的互补基因高表达（图3a–c）。有趣的是，这些组织特异性基因包括与微管和细胞骨架相关的基因（TUBA1A，TUBA1B，TUBB，TUBB4B；S100A4），以及编码细胞基质、膜支架和粘附分子基因（VIM或波形蛋白，半乳糖凝集素LGALS1 / LGALS3，AMICA1，ITM2C，EZR，膜联蛋白ANXA1/ANXA2）（图3a–c）。与血液相比，组织中的ITM1和ITGAE等TRM特征基因也被上调，尤其是在肺中（图3a–c）。这些发现表明，T细胞在组织中的定位可能涉及促进与组织基质相互作用的细胞结构变化。对血液和组织中组织标志基因表达的单细胞分布进行比较（图3d）。与血液相比，来自三个组织的CCL5+ TEM细胞组织标志基因的表达水平更高，其中LG和LN T细胞的表达高于BM（图3d）。热图分析组织标志基因的表达水平，包括TRM细胞富含的基因以及与细胞骨架、细胞基质相互作用、细胞分裂、凋亡和信号传导相关的基因（图3e），LG中组织标志基因的表达最高，其次是LN和BM；来自血液的仅表达一部分（<40％）（图3e）。当使用组织相关的特征基因通过UMAP观察静息TEM细胞时，血液T细胞在所有组织中均明显聚集，而LGT细胞在LN和BM中则明显聚集（图3f）。值得注意的是，来自BM和LG的T细胞子集与血液T细胞的聚集更为紧密（图3f），表明这些部位存在循环T细胞。总之，这些结果表明，组织T细胞表达与浸润和定位相关的基因以及驻留标记，而血液仅包含痕量表达这些基因。
图3 静息记忆T细胞的组织标记基因的鉴定。a 火山图显示了来自每个静息LG样本和每个静息血样的CCL5+ T细胞之间成对差异表达的平均对数倍变化和平均p值。具有负对数倍数变化负值的基因在LG中的CCL5+细胞中表达更高，几个差异表达的基因以红色突出显示（p<0.05，倍数变化> 2）。 b与（a）相同，用于比较BM和血液中静止的CCL5+ T细胞。 c与（a）相同，用于比较LN和血液中的静息CCL5+ T细胞。 d小提琴图显示了组织和血液样本静止CCL5+ T细胞的所有差异表达基因（变动倍数＞2，FDR <0.05）的平均表达分布。e 热图显示来自组织和血液样本的静息CCL5+ T细胞中来自组织标志基因和血液稀有亚群（d）的z评分平均表达。之前研究中鉴定出的TRM相关基因（富含CD69+与CD69-组织记忆T细胞）以红色突出显示，与TRM比TEM细胞上调的CD27以蓝色突出显示。 f UMAP降维分群图，来自所有供体的静止CCL5+ T细胞（TEM细胞），分别依据组织部位（左）、供体（中间）、标志基因的平均表达水平（右）着色。为了揭示整个激活过程中不同组织中T细胞群体保守的基因表达模式，使用一种称为单细胞层次泊松矩阵分解（HPF）的新分析方法，用于分别来自每个组织和供体的静息和活化T细胞的合并，并在层次上对所得因子进行聚类（图4a）。该分析揭示了在组织和供体之间高度保守的7个基因表达模块（3个静止的和4个激活的/功能性的），其得分最高的基因形成了基因特征标志（图4a）。与静止状态相关的3个模块（图4a）包括：Treg模块被经典的基因定义（FOXP3、CTLA4、IRF4、TNFRSF4（OX40））；假定的静息CD4+初始/中央记忆（NV/CM）模块，富含CD4+ T细胞，被与淋巴结、外向和静止相关的基因定义（分别为SELL、KLF2、LEF1）定义；CD4+/CD8+静息模块，以T细胞存活所需受体IL7R和未知功能的淋巴细胞水通道蛋白AQP3的表达来区分。重要的是，CD4+/CD8+静息模块不含血液中的因子，对于图3中所示的组织特征具有最高的富集度。4个模块与T细胞激活和/或功能相关，其中一些是谱系特异性的。一个是由活化的CD4+和CD8+谱系表达的增殖模块，包括与T细胞活化/增殖（IL2、LIF）和细胞分裂相关的基因（CENPV、GOS2、ORC6）（图4a）。该模块还以NME1的表达为标志，而NME1是一种以前与T细胞不相关的转移抑制基因/核酸内切酶编码基因（图4a）。一个是在激活的CD4+ T细胞中富集的干扰素（IFN）反应模块，包括与典型IFN响应基因家族（IFIT3、IFIT2、STAT1、MX1、IRF7和JAK2）。相反，富含CD8+ T细胞的模块包括：一个细胞毒性模块，其中包含与细胞毒性相关的基因（GNLY、GZMK）和与效应子/记忆分化相关的转录因子（ZEB2、EOMES、ZNF683）；一个细胞因子模块，其编码趋化因子和细胞因子（CCL3、CCL4、CCL20、IFNG、IL10、TNF）、抑制分子（LAG3、CD226（TIGIT）、HAVCR2（TIM3））和广泛表达的同源盒蛋白HOPX。这些结果表明在血液和组织部位的人类T细胞功能状态的有限的谱。为了了解这些基因模块如何与CD4+和CD8+ T细胞中的静止状态和激活状态相对应，在其排名靠前的基因的平均表达进行可视化（图4b-e）。其中左边有静止的T细胞（蓝色），右边突出了激活的T细胞（红色；图4b，c）。在2个个体的所有4个位点中，沿着从静息CD4 NV/CM（左）到IFN-响应（中）到增殖（右）的激活轨迹定位CD4+ T细胞的模块表达（图4d）。增殖模块内基因的表达与NME1和IL2RA的峰值表达共定位，而IFN反应模块基因在轨迹中部表现出峰值表达，以排名靠前的IFIT3表达为例。在CD8+ T细胞中，所有因子的细胞因子模块均位于活化最强的细胞中（图4e），而在静息和活化细胞中均表现出细胞毒性模块（图4e）。因此，scHPF采用无偏见的方法发现不同位置保守的人类T细胞的主要功能状态、参考特征和激活轨迹。
图4 通过单细胞层次泊松矩阵分解（scHPF）定义静止和活化T细胞中保守的转录状态。a热图显示了通过对scHPF因子（列）进行聚类确定的每个表达模块中最高基因（行）的得分。所选基因显示在左侧，底部的色条指示每个因素的来源组织、供体和CD4/CD8的偏差。。 b每个组织和供体中CD4+ T细胞的扩散图，其中按样品来源分类的细胞为静止（蓝色）或激活（红色）。 c与（b）相同，但是对于CD8+ T细胞。 d来自（b）的CD4+ T细胞的扩散图，其中的细胞按照scHPF表达模块顶部基因的平均表达水平分类。使用RGB颜色模型混合不同模块的颜色。 e来自（c）的CD8+ T细胞的扩散图，其中的细胞按照scHPF表达模块（CD8细胞毒性和CD8细胞因子）中最重要基因的平均表达水平分类。4 活化的CD4+ T细胞中的II型IFN反应状态图4中CD8+ T细胞的功能状态与在小鼠感染模型中观察到的相一致，但鉴定为CD4+ T细胞活化的模块揭示了通常不与效应CD4+ T细胞相关的标记和功能状态。因此，通过qPCR评估了T细胞体外激活过程中分别在增殖和IFN响应模块中得分最高的基因NME1和IFIT3的表达动力学。与未经刺激的对照组相比，CD4+和CD8+ T细胞中NME1的表达在TCR刺激后迅速增加，在16至24小时之间达到峰值，并在长达72小时内保持升高，这种表达方式与典型的T细胞活化标记IL2RA类似（图5a）。值得注意的是，与CD8+ T细胞相比，CD4+中NME1的激活相关上调程度更大，而CD8+ T细胞中IL2RA上调程度更高（图5a）。在蛋白质水平上，TCR刺激后24到120小时，CD4+和CD8+ T细胞中NME1的表达在每个连续的T细胞增殖周期中增加，CD25的表达一样，独立于细胞分裂（图5b）。以上结果表明NME1表达可以作为T细胞活化的标志物。与NME1/IL2RA上调相反，干扰素诱导的转录本IFIT3的表达在TCR刺激CD4+ T细胞后瞬时上调，在刺激后16小时达到根峰，48小时恢复到接近基线水平（图5c）。相比之下，将T细胞与IFN-α（I型）或IFN-γ（II型）一起培养，IFIT3迅速被诱导（在2小时内），并在整个培养过程中持续存在（图5d，e）。为了确定I型或II型IFN信号传导对TCR触发的诱导IFIT3的贡献，在培养物中加入针对I型或II型IFN的封闭抗体，发现完全抑制了I型IFN对IFIT3的诱导，但TCR介导的IFIT3上调不受影响（图5d）。但是，对II型IFN信号的阻断可抑制外源性IFN-γ和TCR介导的刺激对IFIT3的上调（图5e）。重要的是，通过NME1转录表达推测出阻断II型（或I型）IFN信号传导不会抑制T细胞活化，并且添加IFN-α或-γ不会诱导NME1表达（图5d，e）。这些结果证实了scRNA-seq轨迹所暗示的IFN反应状态是由TCR触发的IFN-γ产生驱动的中间激活状态。
图5 在T细胞活化过程中NME1和IFIT3表达的诱导。a通过qPCR检测用抗CD3/抗CD28抗体刺激后，血液CD4+或CD8+ T细胞NME1和IL2RA mRNA表达水平。b刺激后指定时间点（红色）与未刺激（黑色）和同型对照（灰色）相比，血液T细胞的细胞内NME1蛋白表达。c TCR刺激后通过qPCR检测血液T细胞中IFIT3 mRNA的表达。d培养的CD4+ T细胞中IFIT3或NME1 mRNA表达，用抗CD3/抗CD28或IFNα2（1000单位/ mL）±I型IFN中和抗体混合物或e IFNγ（10 ng / mL）±抗IFNγ-抗IFNγR1抗体（每个1μg/ mL）。为了证明本研究可作为人类疾病的参考，使用UMAP将最近报道的来自四种不同人类癌症的肿瘤相关T细胞的scRNA-seq图谱投影到T细胞活化状态图上。合并了来自4个供体和4个部位的所有T细胞数据（图6a），并按组织部位、供体、刺激、簇水平CD4/CD8状态和指示效应子状态的CCL5表达进行着色。将来自四种不同癌症（非小细胞肺癌（NSCLC）、结肠直肠癌（CRC）、乳腺癌（BC）和黑素瘤（MEL））的肿瘤相关T细胞的scRNA-seq图谱进行投影（图6b，c）。还研究了健康T细胞和肿瘤突起中激活状态和谱系标志物的表达（图6c）。肿瘤相关的CD8+ T细胞从静止和激活状态的所有部位投射到健康的CD8+ T细胞上（图6b）。此外，与TRM（CXCR6）、细胞毒性和细胞因子模块相关的基因均在与肿瘤相关的CD8+ T细胞中表达（图6c，7）。相比之下，肿瘤相关的CD4+ T细胞主要投射到静息血液和组织T细胞上（图6b），而CD4+ T细胞的活化状态和相关标记（NME1、IFIT3）则基本上不存在（图6c）。上述结果揭示了肿瘤相关的T细胞具有活化的CD8+ T细胞状态，但不存在功能性活化的CD4+ T细胞状态。肿瘤相关的T细胞的标志是低反应性或功能衰竭状态，其特征在于持续表达的表面抑制性标志物包括PD-1、CTLA4、LAG3、TIM3等，其中许多是在T细胞活化后表达的。其中PD-1、CTLA4是免疫疗法中促进抗肿瘤免疫的重要靶点。研究人员比较了健康和与肿瘤相关的T细胞中的功能衰竭和功能性标志物的表达（图7）。肿瘤相关的CD8+ T细胞在所有四种肿瘤类型中均表达功能衰竭标志物，投射到本研究图中激活的CD8+ T细胞上，并在细胞因子模块表达基因（CCL3、CCL4、XCL1、XCL2和IFNG），在较小程度上表达细胞毒性模块（图7）。有趣的是，这些与肿瘤相关的CD8+ T细胞（而不是健康的T细胞）的一部分高表达MKI67，与增殖细胞和其他细胞周期控制标志物相关（图7）。因此表达功能衰竭标志物的蛋白也表达与正常CD8+效应子T细胞功能和持续增殖相关的基因。
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