科研 | Cell：单细胞RNA测序揭示出生后皮肤表皮生长的原理
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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在胚胎和出生后发育过程中，器官和组织稳定发育，直至青春期末达到最终大小。然而，关于出生后发育的细胞动力学知之甚少。通过结合体内细胞克隆谱系示踪、增殖动力学、单细胞转录组学和体外微模式实验，研究人员揭示了出生后皮肤表皮生长过程中发生的细胞动力学。数据表明，增殖过程是由单一的发育祖细胞群体实现的，它们代表自我更新分裂的固定命运，并伴随着增殖率不断下降。单细胞RNA测序显示，与成体干细胞和祖细胞相比，表皮发育祖细胞形成更均匀的群体。最后，研究人员发现细胞分裂方向的空间模式是由潜在的胶原纤维方向局部决定的。研究结果揭示了器官生长的简易原理，其中祖细胞和分化细胞与其周围组织协调一致地生长。
论文ID
原名：Defining the Design Principles of Skin Epidermis Postnatal Growth
译名：出生后皮肤表皮生长的原理
期刊：Cell
IF：36.216
发表时间：2020.04
通讯作者：Cédric Blanpain
通讯作者单位：比利时布鲁塞尔自由大学干细胞与癌症研究所
DOI号：10.1016/j.cell.2020.03.015
实验设计
研究人员以小鼠尾巴和脚掌表皮为模型，揭示了出生后皮肤扩张的克隆动力学及其潜在机制。结合增殖动力学、体内细胞克隆谱系示踪、数学建模和单细胞RNA测序，结果使用免疫荧光组化、定量克隆分析、流式细胞荧光分选技术（FACS）等进行验证。
结果
细胞间表皮（IFE）在出生后发育过程中呈线性增长
小鼠尾巴表皮由两个不同分化的区域组成：内层包围着毛囊（HF）三联体，其特征是表达K1和K10的上基底细胞，而外层的特征是在分化的细胞中表达K31、K36和K84。在成年小鼠中，这两个区域是相互独立的，分别由各自的干细胞和祖细胞维持。但是，如何以及何时在发育过程中指定这些干细胞（SC）、祖细胞及其区室化尚不清楚。
为了解决这些问题，研究人员首先测量了出生后第1天（P1）到第60天（P60）的尾巴的长度、宽度和总面积来评估尾巴的生长。结果表明，尾巴表面从P1到P30线性增长约12倍，然后缓慢达到平稳状态。大部分扩张是由于尾巴伸长（从P1到P60的7倍），而在同一时期，其直径仅增加了2.5倍（图1A-1E）。总之，数据表明，在出生后生长期间，尾巴表面以各向异性的方式增加了17倍。
然后，研究人员在微观水平上研究了出生后尾巴生长。使用HF三联体作为参考，测量了外层和两个相邻内层区域的一半所覆盖的IFE区域，并定义为HF区域（图1A，1B）。由于出生后不会有新的HF形成，因此HF区域的长度和宽度可用作测量局部组织生长的指标。研究人员发现，沿着前后（AP）轴的两条HF线之间的距离增加了（从P1到P60的7倍），比沿着左右（LR）轴的两条相邻的HF三联体之间的距离（从P1到P60的2.3倍）增加了更多（图1F-1H）。总的来说，HF区域从P1扩张到P60约16倍。因此，宏观和微观测量得出的统计结果相似，表明IFE表面从P1均匀扩张到P60，从P1线性扩张到P30（图1I）。
图1 IFE在出生后发育过程中呈线性增长
发育祖细胞（DP）的谱系示踪概括了组织的生长
为了研究单细胞分辨率下IFE扩增的时空动态，研究人员使用多色谱系追踪方法进行了克隆分析（图2A和2B）。他莫昔芬（TAM）以P1的剂量用于K14-CreER/Rosa-Confetti小鼠，并引起彼此充分分离的基底细胞（BC）中荧光报告基因的表达，从而能够追踪目标单个细胞的命运和扩增。每个克隆的BC和上基底细胞的数量在内层和外层的不同时间点进行量化（图2C和2D）。在两个区域中，克隆从P1到P30迅速增长，然后从P30到P60缓慢增长（图2E和2F），反映了尾巴表面及克隆生存（或持久性）从P7到P60在内层和外层总体稳定（图2G），这是BC自我更新分裂而导致克隆扩增失衡的标志。重要的是，克隆大小的总体增加与整体组织的扩张非常吻合（图2H），并且BC的大小没有随时间变化，表明谱系追踪实验中靶向的细胞代表了那些驱动整个组织扩张的细胞。
有趣的是，研究人员发现外层克隆在所有时间点上始终都比内层克隆大（从P1扩张到P30分别为21倍和10倍），这不能归因于差异性克隆丢失（图2G）。此外，内层和外层的累积克隆大小分布在所有时间点都具有单一指数依赖性（图2I和2J）。该观察结果标志着来自单种群DP的随机细胞命运选择，它们介导了出生后的相对生长。
图2 DP的谱系追踪再现组织生长
出生后发育期间DP的增殖率不断下降
为了确保由单个DP细胞支持的组织的准线性生长，这些细胞必须逐渐减少自我更新分裂对最终分化的所占的比例，或者平稳地调整其增殖速率和从基底层到角质层的转运时间。为了区分这些可能性，研究人员在出生后的不同时间点使用K5tetOFF/Tet-O-H2BGFP小鼠进行了定量标记稀释实验。在没有强力霉素（Dox）的情况下，H2B-GFP在所有BC中均以高水平均匀表达。从P1、P7、P21或P30开始用Dox来追踪H2B-GFP的表达，在不同的时间点，用流式细胞荧光分选技术（FACS）对BCs中的H2B-GFP标记稀释水平进行定量，该稀释水平代表了追逐期内细胞分裂的数量。这些数据表明，在出生后的发育过程中，细胞分裂的速率下降，P1和P7之间的平均细胞周期时间约为1.2天，P7和P15之间的平均细胞周期时间约为1.9天，P21和P28之间的平均细胞周期时间为4.1天，在P60时为6.5天。
尽管H2B-GFP标记稀释数据显示DP细胞分裂的速率随时间降低，但FACS定量无法区分内层和外层克隆的差异扩增，是由细胞增殖速率的差异还是对称分裂的不同失衡所导致的。为了区分这两种可能性，研究人员使用EdU/BrdU双标记实验进行细胞增殖动力学测量，从而可以定义细胞周期时间是否以区域特异性方式调控出生后发育过程。首先在P4、P7、P15、P30和P60给予EdU，然后连续给予BrdU，在不同时间点测量内层和外层的双标记细胞的比例（以及上层EdU+细胞的比例）（图3A–3O）。这些结果证实，细胞周期的再进入率会随着时间的推移而降低，并证明DP周期在外层中快于内层（图3N–3P），类似于它们在成年体内稳态过程中的差异增殖率。研究人员认为出生后发育过程中DP增殖率的持续不断降低，可以解释尾部表皮的线性而不是指数增长以及比例间差异的增长。
为了确定细胞自主或非自主机制能控制出生后发育过程中观察到的增殖率不断降低，研究人员评估了从不同年龄小鼠体外培养48h的原代角质细胞的增殖率。通过FACS分析对BrdU掺入的定量显示，随着小鼠年龄的增长，培养的角质细胞的增殖减少，这与研究人员在体内发现的相似（图3Q）。这些数据表明，角质细胞增殖的减少不是年轻小鼠血清中生长激素水平升高的结果，而是角质细胞自主机制的结果。这些结果并不排除生长激素修饰角质细胞的表观遗传和转录调控，使其对生长因子更敏感的可能性。
持续的对称更新会影响出生后发育
仅当DP以对称分化为代价增加对称更新的数目，从而造成不对称而有利于自我更新时，才能实现每个克隆BC数量的增加以及稳定的克隆持久性。为了测试增殖率随时间的调整是否足以定量地解释出生后发育的时空动态，研究人员使用了谱系追踪数据的定量建模。以实验测得的增殖速率作为模型的输入，并考虑到克隆大小分布始终由单个指数拟合的观察，研究人员探讨了平均克隆大小和克隆持久性是否可以用一个由随机命运行为的单DP种群组成的最小模型来解释。
在动态平衡环境中，克隆动力学弱依赖于不对称分裂的可能性（1-2r），而主要依赖于∆λ的乘积，其中∆是对称分裂之间的失衡程度（此处为自我更新和分化分裂），而λ是细胞分裂率。这些模型的结果对自然命运调控不敏感（例如，内在命运与外在命运的选择，或者分化是回馈还是由细胞增殖介导）。有趣的是，根据测得的细胞分裂速率，研究人员发现持续命运失衡∆=24％±4％（最佳拟合±95％置信区间），非常适合内层克隆拟线性P1至P30的生长动力学（图4A和4B）。此外，该模型还为克隆的持久性提供了良好的预测，显示出初始下降，然后是平台期失衡（图4C），这是细胞命运失衡的特征。更令人惊讶的是，外层克隆的建模表明，相同的持续命运失衡∆=24％±2％（最佳拟合±95％置信区间）在整个出生后的发育过程中非常适合克隆大小（图4D-4F）。这意味着克隆生长在外层上的2倍增强可以用观察到的比内层更快的增殖率来解释。这些数据表明，内层和外层的区域均由单一的DP种群维持，DP种群经历过多的对称更新分裂并在出生后发育期间根据其定位获得不同的增殖率。
为了验证这个简单的恒定命运失衡模型，研究人员在P15进行了另一个谱系追踪实验，追踪克隆4天和14天（图4G-4U）。在内层范围内，克隆在2周内平均基础大小增加了1.9倍，平均总大小增加了4.1倍（图4J，4L，4N和4O）。有趣的是，这种平均克隆大小的扩张以及从P4到P15的持久性演化，与模型预测非常吻合（图4R-4T）。同样，外层克隆的基础含量增加了2.9倍，总含量增加了6.2倍，这在平均克隆大小和持久性方面也与模型预测非常吻合（图4K，4M，4P，4Q，4S和4U）。这些数据证实表皮细胞在生长过程中不会改变其细胞命运失衡。
然后，研究人员评估了在尾部表皮中发现的这种组织生长机制，是否是表皮出生后扩张的策略。为此，研究人员以单细胞分辨率研究了爪子表皮出生后生长的细胞机制。研究人员使用在P1诱导的K14-CreER/Rosa-Confetti小鼠进行了克隆分析，并评估了与爪子的长度和宽度有关的单个BC在P4、P7、P15、P30和P60的克隆行为。从P1到P60，爪子面积扩大了6.1倍，并且与尾部相比以各向同性的方式扩张（长2.73，宽2.43）。尽管它比尾部更早到达平台期，但大多数爪子扩张都以近乎线性的方式发生（图1I）。研究人员给予了一个BrdU脉冲，并在4小时后定量了标记细胞的比例，该比例可用于估算增殖速率。有趣的是，BrdU标记的细胞比例从P1降低到P15，从P1的29.8％±2.3％降至P15的12.0％±1.9％，然后在P15到P60保持稳定。爪子表皮的克隆分析表明，克隆的基础含量从P1扩张到P15为5.83倍，反映了爪子组织的扩张，并且克隆大小分布在所有时间点都通过单一指数很好地拟合，标志着一个单一DP群体负责皮肤扩张。与以前类似的理论模型（用爪子测量增殖率）表明，克隆大小和持续时间数据与用于尾巴的相同持续失衡模型完全吻合，从P1到P15尾部的失衡为20％，表明尾部表皮中未发现的原理也说明了爪子表皮中的皮肤扩张。
图4 持续的对称更新分裂调控出生后发育
持续的失衡介导组织的和谐扩张
研究人员的数据和建模方法表明，DP仅调整其分裂速率以匹配组织生长的时空变化模式，同时在命运选择中保持其失衡近似恒定。几个表皮区域中实施和选择这种策略的原因，一种可能性是这种对称更新的持续失衡状态代表了DP的稳定的细胞固有基态。然而，研究人员推测观察到的生长策略也可以通过表皮生长的简单标准来解释。
研究人员认为，如果系统中唯一的限制是以规定的速度扩张基底层，那么这可以通过多种方式实现（图5A-5D）。例如，DP可以在整个发育过程中保持平衡的细胞命运选择，类似于体内稳态，但具有更高的分裂率，仅产生分化的细胞，这些细胞会同时在基底层和基底上层积聚，从而导致基底DP的稀释，如在果蝇肠道再生中观察到的（图5A）。但是，研究人员的H2BGFP稀释实验未显示出这种分化细胞的积累。第二种可能性是DP首先经历对称分裂的阶段，以快速扩张DP，然后切换到第二阶段的非对称分裂，以生成分化的细胞。有人提出这种所谓的“爆炸”机制对于出生后小鼠肠道的快速形成是最佳的（图5B）。但是，研究人员从P1开始的克隆数据表明，分化的细胞是在出生后早期产生的（图2E和2F）。最后，尽管研究人员的增殖实验排除了这一假设，但如果出生前后的失衡接近100%，并且随后持续下降（图5C），那么类似于体内平衡的恒定分裂率（每4-5天分裂一次）就足以引起观察到的线性增长。有趣的是，所有这些情况要么导致DP的稀释（图5A），要么导致很少的基底上细胞产生，导致皮肤在扩张过程中变薄，并可能损害皮肤屏障功能（图5B和5C）。因此，研究人员推测了一种非常简单的表皮生长原理：基底面积必须增长（响应于基础组织的生长）规定的量，而且上基底细胞与BC的比例必须保持恒定（以确保在整个扩张阶段有足够的表皮厚度）。总之，这两个约束只与一个单一的理论增长相兼容，其特征是（1）接近恒定的命运失衡和（2）不断降低分裂率以适应增长特征（图5D）。因此，该原理为实验观察到的克隆动力学提供了简单而可靠的解释，研究人员对其进行了定量研究。
在进一步将此最优标准与数据进行定量比较之前，研究人员试图验证其假设是否适用。为此，研究人员在尾以及爪子中的内层和外层所有时间点测量了上基底细胞与BC的比率。重要的是，研究人员发现该比率在整个生长期都大致恒定（图5E和5F），验证了模型的关键假设。此外，在尾巴中，该比率在内层和外层上是相等的，尽管两个区域的生长程度都存在2倍的差异（图2E，2F和2H）。然后，研究人员试图通过对克隆数据进行分段拟合，以推断不同的失衡值，来检验恒定失衡的假设。有趣的是，研究人员发现每个时间点的推断失衡都接近其总体拟合值（图5G和5H）。最后，为了查看其他可能的情况是否也适合研究人员的实验数据，研究人员进行了敏感性分析，以预测每种情况下BC密度和上基底/基底细胞比率的时间演变。令人惊讶的是，该分析证实研究人员的恒定失衡模型是最合适的方案。
通过单个拟合参数（上基底的丢失率，研究人员将其设置为常数，但对所产生的动力学影响很小），该原理便可以定量预测以下数据：（1）每次通过实验推断出的失衡点（即，尽管它们具有不同的增长率，但时间上应保持恒定，并且在内层和外层上应保持一致）和（2）在整个生长期中实验测量了生长期内层和外层分裂率的演变以及观测到的外层增强的分裂率（图5G，5H）。这说明DP在整个生长过程中的增殖动力学和命运选择的演变可以用简单的原理来预测，并表明它们是为了协调基底和上基底的扩张而优化的。
图5 持续的失衡介导和谐的组织扩张
出生后扩张与成人体内稳态之间的过渡
如上所述，P30之后尾巴的整体生长动力学急剧减慢，这反映了克隆大小演变。确实，首先针对外层区域的P30–P60克隆大小演变的建模方法，研究人员发现这与研究人员先前提出的稳态模型相一致，其特征是一个定向祖细胞（CP）群体的命运选择完美平衡。这表明在P30左右或之后发生从失衡的细胞行为过渡到平衡的细胞行为。而内层区域，尽管P1诱导不能提供检测SC/CP层次结构出现的分辨率，但P30-P60克隆大小的进化也与P30周围向稳态、平衡细胞命运的急剧转变相一致，因为使用稳态SC/CP模型可以很好地拟合数据，尽管与体内平衡相比，从CP向分化的命运失衡加剧。
为了进一步检验这些发现，研究人员在P30进行了另一个谱系追踪实验，追踪克隆4天和4周。与它们较低的增殖率一致，内层克隆在4周内仅将其平均基础大小增加了2倍，将其平均总大小增加了5.3倍。稳态模型可准确预测平均克隆大小和克隆持久性。同样，外层克隆在4周内增加了基础含量2.43倍和总含量6.23倍。同样，该模型始终能够很好地拟合外层克隆的大小和持久性。这些数据表明，P30左右在内层和外层发生了从失衡细胞命运向平衡细胞命运的过渡，内层SC的克隆动力学出现在发育后期，大概是在向稳态的过渡阶段。
出生后和成年尾表皮的单细胞RNA测序
为了研究与DP相关的分子特征，并将其与体内稳态中的成人SC和/或CP（SC/CP）进行比较，研究人员使用10X Genomics平台对FACS分离去除年轻（P7）和成年（P60）小鼠HF细胞的基底尾巴角质细胞进行了单细胞RNA测序。研究人员进行了无监督的聚类，并排除了漏斗状的细胞簇（Sox9high，Krt17high和Krt79high）、皮脂腺细胞（Scd1high，Mgst1high和Elovl6high）以及线粒体基因含量高的细胞，例如mt-Co1（即将死亡的细胞），并在IFE细胞上进行了进一步的生物信息学分析。处理后，进一步分析了P7和P60的6102和7551个细胞。研究人员使用Seurat软件对单个样品进行了无监督聚类，并根据生物学标准得到了更好的分离度（图6A和6B，左图）。为了更好地比较年轻表皮和成年表皮，研究人员还使用Harmony软件合并了这两个数据集，这是一种批量的方法，适用于在细胞类型或状态之间连续转换的数据集，并根据各个聚类进行注释（图6A和6B，右图）。有趣的是，与克隆命运数据的建模一致，单独的聚类分析表明，与成年IFE细胞相比，年轻的IFE细胞更为同质（图6A和6B）。在P7，根据Krt5的高表达的BC（图6C）可以根据它们在细胞周期的不同阶段（G1-S，细胞簇3；S-G2-M，细胞簇2；G2-M晚期，细胞簇4；图6A-6F）进行进一步聚类，以及其较高的已知基底SC标记基因（例如Ccnd2，Col17a1和Sparc）的表达，它们突出显示了G0中的两个细胞群体（DP G0，一个主要细胞簇0和一个较小的细胞簇5；图6G-6I）。通过分化标记如Sbsn的表达来定义更多定型细胞（定型和分化细胞，细胞簇1；图6J）。同样，成年尾表皮聚类显示了BC细胞周期相关的聚类（G1-S，细胞簇3；G2-M，细胞簇4；图6B-6F），以及表达Krt5和Krt1的定型BC（细胞簇0；图6B，6C和6K）。发现了两个分化细胞簇，分别对应于富含Krt1和Krt10表达的内层区域（细胞簇5）和外层区域（细胞簇7），它们表达了较高水平的外层标记基因Krt36和Krt84（图6B，6K，6L和6B），在年轻样品中不表达，如出生后发育过程中外层标记的进展所预测的。相反，成年尾巴表皮的聚类发现，G0中的BC可以根据不同转录标记细分为3个不同聚类（细胞簇1、2和6）。与研究人员在P7中发现的类似，称为SC/CP G0（I）的G0细胞簇1表达更高的Sostdc1、Postn或Ifitm3（图6M）。第二个G0细胞簇（细胞簇2，SC/CP G0 II）表达较高水平的Mt1/2、Tsc22d1或Dcn（图6N），而第三个细胞簇（细胞簇6，SC/P G0 III）表示较高的水平的Wnt相关基因，例如Wnt3，Wnt4，Wnt10a，Wls以及Igfbp2、3、7，Il1r2和Tgm3（图6O）。有趣的是，最后一个特定细胞簇的基因由DP G0 II在P7样品中表达，表明成年小鼠中BC的分子分离或异质性更高（图6N，6O）。一些小细胞簇（细胞簇6、7和8；图6A和6B）仍然高表达Krt17和Sox9，或者表达的Krt6水平很高，在G2-M和伴层细胞中被认为是漏斗细胞。SCENIC分析可以预测活性转录因子（TF）及其推定的靶基因，这些基因控制着干细胞和祖细胞以及它们分化的细胞的身份，表明DP富集调控因子与Jun、Fos或Trp63相关，而定型和分化的细胞富含Klf4、Klf5和Hes1基因，符合Notch信号通路和这些TF在促进皮肤分层方面的既定作用。最后，使用Slingshot进行的谱系轨迹分析揭示了P7的一个分化路径和成年的2个分化路径（外层和内层），根据其贡献分离出不同的细胞簇，并显示了从SC/CP G0（I）到SC/CP G0（III）亚群的一条路径（图6P）。总而言之，这些单细胞RNA测序数据进一步支持出生后皮肤扩张过程中DP更为均一的存在，以及向成年IFE动态平衡过渡过程中细胞异质性的增加。为了确定何时出现这种细胞异质性，研究人员在克隆动力学从生长变为稳态的P30时，对一只年轻成年小鼠的尾部表皮进行了单细胞RNA测序。经过质量控制过滤后，研究人员分析了成年SC/CP群体中鉴定出的所有标志基因的表达，并将其与P7和P30样品的基底群体进行了比较。在P7处的两个BC群体之间的差异很小，与成年相比，表明基底区域中更高的分子同质性。成年SC/CP G0 I的标记基因（例如Sostdc1和Ifitm3）在所有三个样本的一部分BC中有更高的表达，从而在所有三个数据集中定义BC群体I。如前所述，来自成年SC/CP G0 II和III的一些标记基因（例如Dcn，Igfbp2和Wnt4）在P7的第二个DP群体（DP G0 II）中共表达，而其余大多数标记基因表达都很弱。在P30时，大部分SC/CP G0 II群体中表达了SC/CP G0 II的标记基因（Dcn，Mt1，Mt2，Gpha2和S100a6），与SC/CP G0 III标记基因（Igfbp2，Igfbp7和Wnt4））共表达。最后，三个SC/CP G0群体在P60时分子层面上是不同的。为了更好地观察3个时间点之间基底表皮细胞异质性的差异，根据成年SC/CP G0 II（x轴）和III（y轴）特异性标记基因的曲线下面积（AUC）值绘制BC。尽管在年轻样本中所有BC都显示出两个AUC值之间的线性相关性，但是相比之下，某些BC已经开始偏离P30的趋势，而在成年样本中甚至更加强烈。总而言之，这些数据表明，在出生后早期发育过程中，尾部表皮的BC更均一，并且细胞异质性始于P30左右，即从生长的分裂状态向稳态分裂的过渡时期，并进一步增加直至小鼠达到最终大小。这些数据为控制干细胞和祖细胞异质性的基因及其在出生后发育和成年体内稳态过程中的分化提供了重要的分子见解。
图6 年轻和成年尾巴表皮BC的单细胞RNA测序分析
真皮的局部胶原结构决定了克隆的定向和细胞的分裂
研究人员的持续失衡模型帮助理解在命运结果和分裂率方面，对于一个整体扩张的组织，细胞命运决定的调节背后的原则。但是，它没有考虑到这些选择的几何结构，例如细胞分裂轴的调节。尽管研究人员的克隆分析数据表明DP经历了很高比例的对称自我更新，进一步研究表明，分裂后两个DP的空间定位不是随机的。在一个简单的各向异性生长上皮细胞中，可以预期克隆的方向是净生长的。但是，尾部表皮内的克隆显示出更复杂的几何结构。在出生后的扩张过程中，一部分克隆是各向同性的，并且在每个方向上均等，而其他克隆则是各向异性的，优先在与AP轴或尾巴的LR轴平行的一个方向上增长。研究人员将内层划分为两个区域（内层AP和内层LR），并量化每个区域中克隆的比例和方向。在P30时，大约70％的克隆按外层排列，内层AP比例为23％，内层LR比例为7％（图7A）。在每个区域中，大约70％的克隆是各向异性的（图7B）。测量各向异性克隆的方向显示了复杂的克隆方向模式，内层LR克隆垂直于尾巴的长轴定向（图7C），内层AP克隆平行于尾巴的长轴伸长（图7D），并且外层克隆平均角度在40°到80°之间（图7E）。令人惊讶的是，虽然尾巴在AP方向上呈各向异性生长，但研究人员发现所有克隆的平均方向几乎没有表现出净各向异性偏差。这表明细胞分裂的方向与尾部表皮组织生长的方向不相关。
先前的研究强调了细胞外基质和外力对体外细胞分裂方向的重要性。为了评估真皮的胶原网络是否可以对克隆生长施加方向性提示，研究人员使用了双光子显微镜和二次谐波生成技术，并分析了每个IFE单元中上层真皮中胶原纤维的定向。在P30处，清晰可见大规模胶原蛋白，其定向在AP内层内沿AP方向，在LR内层沿LR方向，并且在外层上接近45°（图7F-7H）。克隆的方向和胶原纤维的方向的定量揭示了两者之间的强相关性（图7I-7K）。这种空间模式与观察到的克隆方向完全匹配，表明两者之间存在功能联系。在较早的时间点也发现了胶原蛋白与克隆方向之间的强相关性。
为了测试胶原纤维的方向是否控制细胞分裂的方向，研究人员使用光刻技术的微图案化来设计具有排列的胶原纤维或不排列的胶原网络的粘合表面，两者的间距均为2mm（图7L）。研究人员在两个表面上培养了原代角质细胞，并对两种情况下的细胞分裂方向进行了评分（图7M）。有趣的是，细胞分裂的方向与胶原纤维的排列密切相关，而细胞分裂在未排列的胶原网络模式上是随机的（图7N）。总而言之，这些数据表明，DP定向的空间组织在发育过程中受上层真皮内胶原纤维的局部分布的调节。
图7 胶原纤维的定向与克隆的各向异性和组织扩张有关
讨论
在这项研究中，研究人员以小鼠尾巴和脚掌表皮为模型，揭示了出生后皮肤扩张的克隆动力学及其潜在机制。通过结合增殖动力学、定量克隆分析、数学建模和单细胞RNA测序，研究人员推测皮肤的出生后扩张是由不同皮肤区域的DP单一种群介导，在单细胞水平上，DP在分裂和分化之间的随机命运选择在种群水平上是严重失衡的。研究人员的数学模型揭示了表皮扩张过程中令人惊讶的简单性。特别是，研究人员发现准线性表皮的生长是通过以下方式进行的：（1）随着时间的推移细胞分裂率不断降低，以及（2）自我更新和分化之间的失衡的中间水平，随着时间的推移，这种失衡状态几乎是恒定的，甚至跨尾巴内层和外层区域。
研究人员提出，出生后表皮生长过程中的最佳状态要求上皮在整个扩张过程中保持BC的恒定密度，并且BC与上基底细胞的比例保持恒定，以确保皮肤的屏障功能，这对动物的生存至关重要。这两个简单的假设（研究人员通过实验进行了验证）只能通过近乎恒定的失衡和不断降低的分裂率来实现，定性和定量地解释了整个表皮出生后发育过程中观察到的原理。这表明在这种模型中，细胞不仅可以调节其命运选择，从而实现内组织扩张，还可以不断调节产生的上基底细胞的比例，以维持表皮厚度。
研究人员目前的模型提出了一个在各个内层和外层区域介导尾巴生长的DP种群，与先前的体内平衡模型形成了对比，在该模型中，提出了由SC和CP组成的更多异构细胞群体在内层共存。不同的假设可以解释这种差异。首先是，IFE仅在出生后发育期间由DP组成，而SC和CP从青春期后的DP衍生而来。第二个可能的假设是，SC在出生时就已经存在，但其动力学与CP相似，并且仅在P30和P60之间才获得缓慢的循环动力学。研究人员的单细胞RNA测序数据表明，与成年BC相比，IFE BC具有更高的同质性，而成年BC则在P30周围出现了额外的基底SC/CP群体，并出现了与内层和外层分化相对应的两个分化状态，从而增加了异质性。BC异质性的增加与克隆动力学的变化相吻合，从失衡转变为更新和分化之间的平衡，表明克隆动力学在出生后生长结束时在P30左右发生变化。
有趣的是，在出生后发育过程中观察到的强烈失衡与致癌性Hedgehog（HH）信号的肿瘤启动过程中所发现的失衡高度相似，但与伤口愈合上报道的克隆动力学形成强烈反差。类似于研究人员在出生后发育中的结果，致癌基因引起的强烈失衡在一段时间内是恒定的，并且伴随着增殖率的下降，导致病变在数周和数月内呈线性增长。相反，受伤后不久，IFE BC增殖会大大增加，但是基底克隆的大小呈线性增长，这表明伤口愈合是一个更快的过程，不会触发自我更新的失衡，而是依靠激活的SC种群产生祖细胞。有必要进行进一步的实验，以研究与细胞命运决定的控制有关的特定信号通路的作用。
尽管研究人员发现克隆水平的表皮扩张与底层组织的扩张相关，但克隆方向的分析显示出更为复杂的情况。确实，研究人员发现细胞分裂的局部方向（以及克隆方向）并不遵循尾巴的生长轴（绝大多数在AP方向上）。取而代之的是，克隆扩张与真皮中胶原纤维的局部定向高度相关，胶原蛋白纤维在整个尾巴扩张过程中表现出清晰的远距离模式。使用定向或非定向胶原的体外微模式，研究人员进一步证明了克隆定向是由胶原纤维的局部模式决定的。有趣的是，观察到的胶原蛋白和克隆定向模式（图7）与果蝇翅盘形态发生中观察到的模式非常相似。在这两个系统中，中央上皮区域的分裂速度快于其周围环境并显示出放射状的克隆，而周围的区域则表现出正交放射的克隆。鉴于这种定向模式可以通过顶点模型在计算机上研究，其中中心区域的增强扩散压缩了周围环境，这表明，在研究人员的系统中，内层和外层区域可能发生类似的竞争，并为克隆提供了一种局部定向机制。进一步的研究将有助于理解这种插入事件是如何被调控的，以及如何在与局部克隆定向分离的同时，随着克隆大小的变化，整体组织的扩展是如何进行的。
评论
总之，研究人员的结果表明，出生后表皮扩张依赖于三个关键参数的严格和局部调节：细胞命运失衡、细胞分裂速率和细胞分裂方向。尽管其中一些参数可能部分由细胞内在因素决定（例如，失衡可以通过基因编程与预期的组织生长或分裂速度相匹配，并在时间上自动衰减），另一个可能的调控候选信号是细胞的外部信号，如真皮下的生长、表皮厚度、细胞密度，以及由其他表皮细胞和外部微环境引起的其他约束。这与最近的研究结果一致，即最近邻相互作用在表皮内稳态过程中对基底细胞分裂和分化的作用，这提供了天然的BC密度调节的机制。鉴于需要在此系统中严格控制分裂率和失衡度以实现正确的大小，因此，这种外部机制有望提高模型的稳健性。需要进一步的实验以了解是否以及如何实施这种反馈（组织大小、局部密度、厚度、分裂率和/或失衡）。在发育和体内平衡过程中，是否在其他环境中调节上基底密度和/或组织厚度仍然是一个问题，需要在未来进行探索，同时表皮和真皮之间的相互作用的本质也是一个将真皮和表皮生长结合起来的问题。
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