重磅综述 | Trends in Genetics：非编码RNA在前列腺癌中的研究进展
编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Landscape of Noncoding RNA in Prostate Cancer
译名：非编码RNA在前列腺癌中的研究进展
期刊：Trends in Genetics
IF：8.34
发表时间：2019年11月
通讯作者：Housheng H. He
作者单位：加拿大安大略省多伦多大学健康网络公主玛格丽特癌症中心加拿大安大略省多伦多大学医学生物物理系
主要内容
非编码RNA（ncRNAs）是包括癌症在内的多种疾病过程中的重要调节因子。从历史上看，从成熟转录本长度的200个核苷酸截断，ncRNAs分为短ncRNAs和长ncRNAs。短ncRNAs包括许多已得到深入研究的种类，如miRNAs和小干扰RNA（siRNAs）。长非编码RNA（lncRNAs）根据其基因组定位和进化谱系可进一步细分为多个种类，包括长基因间RNA（lincRNA）、反义RNAs、正义内含子RNAs、增强子RNAs和假基因。近年来，环状RNA（circRNAs）被认为是一类具有调控潜力的新型RNA。虽然很少有证据表明某些lncRNA和circRNAs可以被翻译，但这些RNA种类中的大多数仍然被认为是非编码的。
在癌症中，许多ncRNAs异常表达，显示出在肿瘤发生或发展中的作用。特别是miRNA在不同类型的癌症中被广泛研究，包括前列腺癌。近年来，有报道显示许多miRNAs可以由缺氧诱导，低氧抑制miR-133a-3p可以在前列腺癌中发挥肿瘤抑制作用。此外，许多miRNAs也被认为是评价前列腺癌进展的生物标志物，特别是用于血液和尿液样本的无创性液体活检。除了miRNAs，lncRNAs和circRNAs是相对较新的研究对象，目前在ncRNA领域，人们对它们了解还比较少。尽管如此，因其多的数量、表达特异性、在疾病中的功能作用和潜在的临床应用使它们得到了人们广泛的关注。本文综述了前列腺癌ncRNA领域的最新研究进展，重点介绍了lncRNA和circRNAs。
lncRNAs是一类独特的RNA，与蛋白质编码的mRNAs有一些相似之处，但通常不编码蛋白质。虽然曾经被认为是转录噪声，但在过去的十年研究中，lncRNAs被高度评价为具有重要生物学作用的一类ncRNA。
与蛋白质编码的mRNA类似，lncRNA由RNA聚合酶II转录，并可在细胞核中进行转录后剪接和修饰。在基因组时代，由国际社会努力推动的大规模转录组研究显示，lncRNA是人类转录组中最普遍的RNA类型之一，随后推动了对其功能作用的研究。2012年，GENCODE鉴定了9640个lncRNA位点和15112个转录本。随着Capture Long Seq等新技术的开发和应用，最新版本的GENCODE报告了16 193个lncRNA位点和30 369个转录本（https://www.gencodegenes.org/human/stats.html）。FANTOM Consortium最近利用Cap分析基因表达技术和RNA测序（RNA seq）技术对1829个人类组织和细胞系进行了分析，识别了27 919个5’端带注释的可信度较高的lncRNA。随着测序和计算技术的不断改进，将来可能会发现更多的低表达或瞬时表达的lncRNA，从而推动转录组中lncRNA总数的增加。因此，这些发现也导致了在功能上查询这一大类ncRNA的科学兴趣的随之增加。
lncRNAs可以通过不同的机制调节下游靶基因的表达，如染色质调节因子和转录因子的募集。在正常生理条件下，lncRNAs可以在发育和细胞分化等过程中发挥重要作用。然而，并不是所有的lncRNA都能发挥作用，因为有些可能是附近转录本的副产品。因此，探讨了不同的方法来优先考虑具有重要作用的候选lncRNA，包括保守性、差异表达、与临床特征的关联以及与SNPs或癌基因突变的关联。值得注意的是，与前列腺癌相关的非编码SNP可以通过调节转录因子结合来调节基因表达，并且它们与lncRNA的关联可以被用来揭示功能性候选lncRNA。
CRISPR技术的变体介导的全基因组功能筛选也揭示了数百个lncRNA的重要作用（图1C）。虽然这些并不关注前列腺癌，但可以采取类似的方法来揭示前列腺特异性的候选lncRNA。值得注意的是，传统的通过非同源末端连接（NHEJ）的CRISPR缺失方法在研究lncRNA方面的效果有限，因为它们缺乏蛋白质编码的能力。相反，删除lncRNAs启动子的配对向导CRISPR方法可以在RNA水平上有效地调节它们的丰度。另外，CRISPR干扰（CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPRa）也可以分别有效地抑制和增强lncRNAs的表达，它们适用于高通量筛选。特别是，CRISPRa方法最近与药物治疗相结合去揭示耐药的候选驱动因素。除了启动子外，lncRNAs的剪接位点也可能是基于CRISPR筛选的合适靶点。
图1：目前lncRNA的研究现状
lncRNAs常在癌症中异常表达。可能的机制包括致癌突变、单核苷酸多态性、拷贝数变异（CNV）、异常DNA甲基化和组蛋白修饰。特别是对于癌症，其中一个最全面的lncRNA数据库，是由7256个来自正常组织、肿瘤组织和细胞系的RNA序测序文库汇集起来形成的miTranscriptome数据集（目录）。该目录鉴定了58 648个跨多组织和癌症类型的lncRNAs，包括727个前列腺癌特异性lncRNAs（图1A）。转录组学研究比较了大量前列腺癌肿瘤和良性组织的RNA表达谱，也发现了数百个和前列腺癌相关的lncRNA，包括PCAT1，PCAT14，PVT1、PCAN-R1和PCAN-R2。此外，一些已发表的前列腺癌RNA测序数据集也是可用的，并且可以为候选lncRNA提供新的解释。
近年来，许多研究通过体外细胞系和体内异种移植模型阐明了各种lncRNA在前列腺癌中的功能作用。例如，前列腺癌中lncRNAPCAT1的上调被发现招募AR和LSD1上调晚期雄激素反应基因，从而促进前列腺癌细胞在细胞系和异种移植模型中的生长。另一项研究报道PCAT1可以作为miR-34a的miRNA海绵稳定癌基因MYC。随着测序技术的不断进步和新的分子和细胞生物学工具的开发，前列腺癌中lncRNA的研究正处于一个火热的时期。不可否认的是，在前列腺癌匹配的全基因组功能筛选中发现更多失调的lncRNAs,将产生大量的可在临床上应用的前列腺癌lncRNAs。
环状RNA是一种经过反向剪接形成共价闭合环的RNA。尽管circRNAs曾经被认为是偶发事件和错误剪接的副产物，但现在被认为是一大类调节性RNAs。CDR1as的鉴定和功能特征化，再加上第一个circRNA图谱，在circRNA研究领域掀起了一股热潮。越来越多的证据表明circRNAs在包括癌症在内的各种疾病中起着重要作用。
circRNAs是一个低效的反剪接过程的结果，它在很大程度上共同拥有RNA剪接的典型机制（图2A）。目前的研究主要集中在已知基因中的circRNAs。从脱支中逃逸可形成内含子circRNA，不同的机制参与了由外显子序列组成的circRNA的产生。各种调节序列和蛋白因子参与了这一过程，circRNAs可以通过共转录和/或转录后产生。
环化外显子两侧的内含子通常富集于互补序列，如倒排重复Alu元件。这样的序列可以通过形成发夹结构使侧翼内含子接近。虽然观察到侧翼内含子和外显子序列之间存在一定程度的协作，但其机制尚待进一步研究。并非所有环化作用都需要互补序列。将QKI结合基元插入到线性RNA中可以诱导反向剪接，这可能是由于与基元结合的QKI蛋白的二聚作用引起。其他剪接因子如MBL、hnRNPs、FUS和NF90/NF110也被报道能够调节circRNA水平。在果蝇系统中，包括SF3a和SF3b在内的典型剪接元件的缺失有利于circRNA的产生，而不是线性剪接元件。circRNAs大多是转录后产生的。转录后环化的间接证据是circRNA产生的线性转录本上需要poly-A。利用4sU掺入实验，直接证据表明大部分环化发生在转录后。
图2：circRNA的生物发生和功能机制
虽然特定的DNA序列和蛋白质因子被证明有助于RNA的环化，组织/细胞类型特异性circRNA表达的直接调节因子尚不清楚。因此，一个重要的问题是，组织/细胞类型特异性表达是严格调控的结果还是不同成环类型的随机选择。目前的证据似乎支持这两个假设：一方面，大多数circRNAs的丰度较低，并且总的circRNAs水平可能受到单个事件的影响，例如典型剪接机制或病毒感染的限制。另一方面，研究发现了数百个高丰度的circRNA，有些circRNA的丰度比对应的线性基因要高。单个circRNAs可以调节特定的基因表达，如致癌，并对细胞增殖产生影响。
由于大多数circRNAs是由已知的线性基因的外显子产生的，它们可以调节这些线性转录本的丰度和功能。特别是，RNA环化的增加可以导致线性转录的减少。所得的circRNAs可以通过与相应的线性转录本的序列同源性进一步竞争RNA结合蛋白。此外，circRNAs的一些机制与lncRNAs的相似（图2A，B）。它们可以通过向启动子招募转录因子来激活基因表达，并充当蛋白质/miRNA海绵或支架。环状结构也可以导致环状RNA的特异性。由于缺乏开放端，circRNAs对miRNA募集的核酸外切酶具有抗性，这反过来又可以在结合时稳定miRNA。值得注意的是，尽管机制最常被研究，但调节miRNA可能并不像CDR1as的例子所推断的那样独特和有效。
由于circRNA缺乏3’ poly-A尾、低丰度和与线性转录本存在重叠的序列，以前的研究低估了在高通量测序时代发现的circRNAs数量。最近的研究突出了circRNAs在各种疾病条件下的普遍性和高度组织/细胞类型特异性表达。迄今为止，已经鉴定出超过40万个独特的circRNA，是线性转录本数量的两倍多。然而，这一数字仍有可能被低估，因为人类仍不完全了解circRNA生物发生的调控。
近的研究已经揭示了前列腺癌中广泛存在的功能性RNA环化图谱。在正常组织、原发性、转移性去势抵抗和神经内分泌前列腺癌中有数百种不同表达的CircRNA被鉴定出来，甚至有些可以独立发挥调控增殖的能力。RNA环化的整体水平与前列腺癌的侵袭性密切相关，单个circRNA通常携带有不同于对应的线性RNA的预后信息。此外，circRNAs与对应的线性转录本相比具有更高的稳定性，在人血浆和患者尿液的外泌体中检测到数千个circRNA，使其成为最小的非侵入性生物标记物的理想候选物质（图2C）。这些研究共同揭示了前列腺癌转录组中具有丰富诊断和治疗机会的非常复杂的一个方面。
显然，研究ncRNAs的结合伙伴和结构对于理解其功能机制至关重要。此外，鉴于前列腺癌是一种高度异质性的癌症，在肿瘤内水平上探索这些细胞类型特异性ncRNAs将是非常重要的。新技术的最新发展将使人类能够探索几十年前不可能深入了解的ncRNA研究的这些关键的领域。
识别相互作用的伙伴是进行lncRNA/circRNA功能研究的第一步，从中研究者可以了解相关的途径和机制。例如，lncRNA SChLAP1被发现可以与染色质重塑复合物（SWI/SNF）相互作用，表明它可能通过调节染色质重塑和易接近性进而发挥作用。最近，一组circRNAs被发现与具有抗病毒活性的核酸受体相互作用，表明它们在调节免疫反应中的作用。为了揭示与之结合的伙伴，各种体外和体内RNA pulldown方法已经被开发出来。
传统的RNA pulldown方法依赖于使用以复合物中感兴趣的RNA为靶点的修饰过的DNA或RNA探针，体外方法包括将含有蛋白质的细胞提取物应用于预成型的RNA探针复合物。相反，在体内方法中，在添加修饰探针以进行随后的pulldown之前，需要内源的蛋白质和RNA。与体内方法相比，尽管缺乏内源性背景，但体外方法相对简单，容易实现，并且可以产生良好的信号。这些方法可与质谱联用，以确定总的RNA-蛋白质相互作用的轮廓。或者，可以提取结合的DNA和RNA进行下一代测序，以揭示DNA和RNA上lncRNAs和circRNAs的结合位点。然而，这些传统的基于探针的方法可能会受到核酸探针潜在的脱靶问题的影响。最近一种新的直接生物素化相互作用蛋白质的方法已经被开发出来，但是还没有被应用于circRNA的研究。
ncRNA研究的另一个新领域是了解ncRNAs的二级和三级结构。虽然ncRNAs与其核酸靶点之间的相互作用很大程度上依赖于序列互补性，但它们与蛋白质的相互作用受其结构的影响。这一点在miRNAs中得到了很好的证明，在miRNAs中，miRNAs前体的茎环结构调节着加工因子的结合。研究还表明，lncRNAs和circRNAs的局部茎环结构可以调节与蛋白质的结合。因此，ncRNAs在特定功能模块或序列基元上更为保守也就不足为奇了，这点类似于蛋白质及其功能区域。尽管如此，对ncRNAs结构的研究在很大程度上依赖于计算预测直到最近。
随着测序和计算技术的进步，加上小化学探针或特殊酶的使用，革新了RNA结构研究领域，这允许直接探测RNA结构。值得注意的是，SHAPE技术后来得到了改进（SHAPE-MaP和icSHAPE），并被用于研究诸如XIST、NEAT1和circRNAs等lncRNA的结构。尽管序列相似，但circRNAs的二级结构与线性结构不同，这导致了功能上的差异。此外，还报道了NEAT1的长短异构体的不同结构。这些研究强调了理解不同ncRNA转录本结构的重要性，这可以为深入了解其潜在的功能机制提供重要的见解。
ncRNAs的表达具有高度的特异性，并且常常受到严格的调控。在癌症中，许多lncRNA和circRNA的表达是特异的对于癌症类型或亚型。虽然ncRNAs的表达在大量转录组分析中普遍较低，但最近的研究发现，在细胞亚群中有更高的表达水平，为研究肿瘤内异质性提供了机会。导管内癌和筛状结构（IDC/CA）是前列腺癌的一种亚病理，与患者的不良预后相关。值得注意的是，lncRNA SChLAP1在前列腺癌中的表达在这一亚病理中高出三倍以上，可能是这一侵袭性特征的一个有用的生物标记物。因此，研究单个细胞水平或跨肿瘤样本空间的ncRNA表达谱，可能揭示前列腺癌独特的分子亚型或罕见的细胞群，并提供肿瘤异质性的分子见解。
单细胞（sc）RNA-seq技术的最新进展为单细胞分辨率下的肿瘤转录组研究提供了新的思路。新的scRNA-seq程序也允许对非poly（A）转录本进行研究。而对前列腺癌细胞进行的scRNA测序分析揭示了雄激素非依赖细胞亚群，目前还没有关于前列腺癌ncRNA谱的研究报道。除了scRNA-seq技术外，空间转录组分析技术可以通过使用空间上唯一的条形码提供跨肿瘤切片的表达谱。利用这项技术，可以生成由正常前列腺、间质和免疫细胞包围的多癌区前列腺肿瘤的无偏空间转录图谱。这些新颖的技术为人类提供了前所未有的机会去获取精确的ncRNAs转录组图谱，并研究肿瘤异质性的分子特征。
据报道，在前列腺癌中，数百种lncRNA和circRNAs处于失调状态；有些甚至比蛋白质编码的mRNAs更严重。随后的研究已经证明了这些ncRNAs在前列腺癌发生和进展中的作用。鉴于lncRNAs和circRNAs的普遍性、表达特异性和功能重要性，将其作为新的生物标志物和治疗靶点在临床上有着广泛的应用前景。
lncRNAs作为癌症生物标记物的应用最为典型的例子是lncRNA PCA3，这是FDA批准的第一个用于前列腺癌诊断的基于lncRNA的生物标记物。PCA3是高前列腺癌特异性，在前列腺癌中的表达是正常组织的34倍，可以在尿液中检测到。这些特性导致建立了一个基于尿液的PCA3生物标志物测试，以确定在前列腺特异性抗原（PSA）水平较高但初始活检阴性的不明确病例中再活检的必要性。除了PCA3外，一些其它的lncRNA，包括MALAT1、PCAT18和SChLAP1，都显示出有作为前列腺癌诊断和预后生物标记物的前景。值得注意的是，SChLAP1已经在一些独立的研究中被评估为转移性前列腺癌的预后生物标记物。
临床上，液体活检越来越受到重视，因为它比传统的组织活检侵入性小，适合于实时疾病监测（图3）。由于其在表达水平上的特异性，lncRNA是基于液体活检的生物标记物中的比较有吸引力的候选者，事实上它们已经在血浆和尿液中进行了检测（表1）。外泌体是细胞外lncRNAs的另一个来源，许多外泌体lncRNAs已经在临床前进行了评估。与对照组相比，前列腺癌患者尿液来源的外泌体中lncRNA-p21的表达升高。有报道称，前列腺癌外泌体对lncRNAs的摄取是选择性的，但确切的机制目前尚不清楚。
circRNAs是一类新的ncRNA生物标记物，在循环过程中具有抗外切酶降解和增强稳定性的特点，在液体活检中具有重要的应用价值。数以千计的circRNA已被证实在血液和尿液样本中更为丰富，个别的circRNA具有不同癌症类型的特征，包括前列腺癌中的雄激素反应性的circSMARCA5。circRNAs作为生物标志物的研究尚处于起步阶段，但已显示出很好的应用前景，并提倡将其应用于临床。
在前列腺癌中具有重要致癌功能的ncRNAs可能成为新的治疗靶点。在临床前研究中，发现lncRNAs SChLAP1、PCAT1、PCAT18和PCAT19有助于前列腺癌细胞的生长和侵袭性。此外，lncRNAs NEAT1和HOXD-AS2与前列腺癌的抗雄激素和化疗敏感性相关。lncRNA介导的耐药性甚至可以通过外泌体在癌细胞间传播。circRNA如circSMARCA5促进前列腺癌细胞生长，抑制细胞凋亡。鉴于他们的重要功能作用，完全有理由将这些致癌的ncRNAs作为新的治疗选择。
两种主要基于RNA的治疗方法是RNAi和反义寡核苷酸（ASOs），它们可以被设计成能够靶向几乎任何RNA区域（图3）。然而，在作用机制上存在差异。RNAi包括利用外源性双链siRNAs或miRNAs通过与内源性miRNA相同的途径靶向致癌的mRNAs和ncRNAs。相反，ASOs涉及单链核酸分子的使用，并通过RNase H介导的靶RNA降解导致基因沉默。近年来，在基于RNA的治疗方法的设计和递送方面有了显著的进步，化学修饰导致靶向特异性和稳定性的提高，以及毒性的降低。第一个基于RNAi的药物Patisiran去年被FDA批准用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性。在最近对Angelman综合征患者的研究中，ASOs也显示了能够靶向lncRNAs的前景。近年来，通过与受体配体的结合和纳米粒子的包埋，这些治疗药物的体内给药方式得到了明显改善。
在前列腺癌中，靶向Bcl-2的ASOs药物Oblimersen和靶向丛生蛋白的药物Custirsen(库司替森)已分别在II期和III期临床试验中得到评价，尽管缺乏疗效。其他ASO药物，如靶向Hsp27的Apatorsen（阿帕托森）、靶向AR的ARRx（NCT03300505）和靶向AR的RNAi（NCT02866916），目前正在进行一期临床试验。虽然目前这些试验集中在蛋白质编码基因，但临床前研究的功能性lncRNA和circRNAs将为基于RNA的治疗提供一系列新的候选方案。
除了在lncRNA和circRNA传递过程中操作的不稳定性外，探索circRNA的独特性质是一个新的研究前沿。工程化的RNA环可以更有效地传递治疗性蛋白质。例如，利用人工合成的circRNAs实现了高质量蛋白质翻译，生产半衰期延长了三倍。此外，还开发了一种Tornado系统，以有效地实现高水平的细胞circRNA适配体和生物传感器的表达。circRNAs作为治疗药物显示出诱人的潜力。虽然其他疾病模型的进展可以为其在前列腺癌中的应用铺平道路，但前列腺癌的研究有必要应对特定组织的挑战。
结论与展望
lncRNAs和circRNAs是前列腺癌领域的两个有前途的核酸分子，具有诱人的生物标志物和治疗潜力。最近的技术进步为ncRNA的研究和临床应用提供了很好的机会。研究者现在开始探索它们的详细功能机制，探索它们在单细胞水平上的表达以用于生物标记物的应用，并通过基于CRISPR的筛选方法筛选治疗靶点。
尽管有这些令人兴奋的突破和期待，但该领域仍有尚未克服的一些挑战和限制。对于研究ncRNAs的相互作用伙伴，基于探针的pulldown方式仍然是lncRNAs的金标准，也是circRNAs唯一可行的方法，因为circRNAs易受脱靶和信噪比问题的影响。涉及生物素连接酶birA募集的新方法需要在内源性lncRNA两侧添加募集序列，这可能导致RNA结构或定位的未知变化。这些方法也不适用于circRNAs，因为它们的5’和3’端是反向拼接在一起的。对于ncRNA结构的研究，SHAPE技术已经彻底改变了这一领域，但是缺乏可扩展性，并且没有完全优化用于转录组范围的研究。此外，这些技术检测核苷酸的局部活性，去预测计算整个RNA结构。目前还缺乏对RNA整体结构进行精确、直接测量的技术。虽然强大的单细胞RNA测序技术scRNA-seq和空间转录组方法会遭受不可避免的随机变化，且目前仅限于高表达基因的检测，这对于表达相对较低的ncRNAs的研究可能并不理想。
尽管存在这些挑战和局限性，ncRNA研究的这些新领域中的重要发现仍在积极地被揭示出来。目前，研究者对lncRNAs和circRNAs的生物合成和功能机制的研究才刚刚起步，并非常看重其在临床上的应用。
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