科研 | Nature Communications：单细胞RNA测序揭示转移性肺腺癌的分子和细胞重组
编译：阿温，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma
译名：单细胞RNA测序显示转移性肺腺癌的分子和细胞重组
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2020.5.8
通讯作者：Myung-Ju Ahn和Hae-Ock Lee
通讯作者单位：三星医疗中心(Samsung Medical Center, SMC)
DOI号：10.1038/s41467-020-16164-1
实验设计
结果
1. 早期、晚期和转移性LUAD的细胞动力学。
为了阐明LUAD发展的细胞动力学，44例患者的肿瘤来源于肺原发组织、胸膜液、淋巴结或脑转移，他们首次治疗LUAD是通过支气管内超声/支气管镜活检或手术切除(图1a)。收集远端的正常组织或淋巴结进行比较分析，我们将208,506个细胞分为9个不同的细胞系，并用经典的标记基因表达进行注释(图1b-d和附图1)，所以确认上皮细胞(肺泡细胞和癌细胞)、基质细胞(成纤维细胞和内皮细胞)、免疫细胞(T细胞、NK细胞、B细胞、髓样细胞和肥大细胞)为常见的细胞类型，而少突胶质细胞仅在脑转移中存在(mBrain)。由于在组织分离过程中引入的偏差，单细胞RNA测序数据高估了免疫细胞在基质细胞和上皮细胞类型中的比例(附图2a)。此外，LUAD的组织学类型也影响肿瘤细胞的治愈率(附图2b)。因此，作者评估了排除上皮细胞和基质细胞后免疫细胞亚群的组成。结果再现了早期LUAD中用CyTOF-MS检测的免疫细胞图谱。肿瘤原发部位最丰富的免疫细胞为T淋巴细胞和髓样细胞(附图2c-d)。此外，结果证实，与正常肺组织(nLung)相比， 早期和晚期肺癌中T淋巴细胞和B淋巴细胞富集，而NK细胞和髓样细胞下降(分别为tLung和tL/B)，表明适应性免疫反应被激活。值得注意的是，转移性淋巴结(mLN)中含有大量的髓样细胞，不同于正常淋巴结(nLN)，说明髓样浸润与转移有关。mBrain样本包含可检测水平的免疫细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)以及少突胶质细胞和髓样细胞(小胶质细胞)。这些细胞组成显示了组织特异性群体的差异，以及肿瘤生长和侵袭造成的总体变化。因此，本研究的LUAD图谱以前所未有的规模和深度揭示了每个细胞成分的细胞动力学和发展相关的变化。
2. 肿瘤内在特征与LUAD发展相关。
在本研究中，作者通过比较分析手术切除的肿瘤细胞和正常上皮细胞来探索腺癌细胞的内在特征。正常上皮细胞主要包括四个不同的亚群，包括肺泡型I (AT1)和II(AT2)，以及棒状细胞和纤毛细胞，能表达清晰的上皮标记物(附图3a-c)。AT1和AT2是最丰富的类型，可以在呼吸道远端激活LUAD。在肿瘤组织中，上皮细胞类型可能包含残余的非恶性细胞和恶性肿瘤细胞。为了从潜在的非恶性细胞中分离出肿瘤细胞，作者使用遗传变异，从基因表达数据中获得拷贝数变异(CNVs)，推断出的CNV模式证实了恶性tLung、tL/B、mLN和mBrain细胞中患者的特异性变化(附图3d)。在随后的肿瘤细胞分析中，作者排除了肿瘤组织中不含CNV的上皮细胞，因为它们身份不明。
利用确定的肿瘤细胞和正常上皮细胞，作者构建了一个转录轨迹(图2a)，以调整患者间的基因组异质性，并找到了控制肿瘤发展的关键基因表达程序。事实上，轨迹中的转录状态显示了正常的分化途径以及与肿瘤发展相关的变化。首先，纤毛上皮细胞和肺泡细胞分别位于不同的轨迹分支，标志着它们的分化状态不同。其次，棒状细胞位于纤毛细胞和肺泡细胞之间，为中间分化状态。最后，肿瘤细胞形成分支结构，正常上皮细胞有两种转录状态(tS1和tS3)；然而，观察到tS2明显位于tS1和tS3分支的两端(图2a-b)。尽管由于细胞成分的代表性有限使得每个患者的轨迹结构不同，但在每个病人的个体轨迹中，反复观察到tS2可以与正常上皮细胞分离开(附图3e)。为了识别细胞状态的转录特征，作者选择了特定于肿瘤细胞或正常细胞状态的差异表达基因。19、28、79、56、33和248基因集被鉴定为肿瘤细胞状态1、2、3 (tS1、tS2、tS3)或正常细胞状态1、2、3 (nS1、nS2、nS3)中显著上调的信号。大部分S1和S3相关基因在肿瘤细胞和正常细胞中均存在，但调节方式不同，与维持表面活性物质稳态、肺泡发育和纤毛运动的正常上皮功能有关(图2c)。相比之下，S2相关基因表现出明确的肿瘤导向特征，如侵袭性细胞运动和异常增殖或凋亡。因此，tS1和tS3状态代表正常分化程序的负调节，而tS2肿瘤细胞状态完全偏离正常的转录程序。
LUAD患者包含不同部位的tS1和tS2肿瘤亚群，tS3数量较少(图2d, tLung)。从晚期活组织检查或转移瘤中分离的肿瘤细胞(tL/B、mLN和mBrain)中tS2特异性基因表达增加，提示与肿瘤发展和转移有关(图2e)。LUAD样本的免疫组化染色显示tS2特异性基因表达在蛋白水平上增加(图2f)。作者使用TCGA数据库中LUAD数据进一步检验tS2标记的临床影响。tS2标记基因高表达的患者与低表达的患者相比，总体生存期较差(图2g)。相比之下，肺鳞状细胞癌(LUSC)的生存期没有差异，这表明tS2信号与LUAD发展有明显的关系。
为了进一步确定与LUAD发展和/或转移相关的基因，作者直接对早期和晚期原发肿瘤之间，或原发肿瘤和转移肿瘤之间进行比较(附图4)。这些两两比较揭示了基因组在肿瘤发展和/或转移过程中存在不同的调节。使用这些基因集进行生存分析，表明晚期特异性基因对LUAD患者生存率低的预测能力最强。
3. 基质细胞协调组织重建和血管生成
为了研究肿瘤微环境中基质细胞的动态，作者获得了6168个假定的成纤维细胞和内皮细胞，如图1b所示，并进行主成分分析(附图5a)。观察到第一个主成分将细胞分成2107个内皮细胞和3794个成纤维细胞，代表性标记基因的表达一致。
内皮细胞(ECs)有8个亚聚类(图3a)。观察到大多数EC聚类属于正常组织，并归属于已知的血管细胞类型，包括尖状和柄状细胞、淋巴管ECs和内皮祖细胞(图3b)。相比之下，在tLung和mBrain样本中，有一个明显的聚类被确定为肿瘤衍生的ECs (EC-C1)(图3c和附图5b-c)。肿瘤ECs显示了VEGF和Notch信号的强烈激活(图3b)，它们调节内皮细胞的发展，决定细胞的命运。肿瘤ECs基因表达网络分析进一步强调血管生成作为上调基因的功能类别(图3d)。因此，脑转移瘤和原发肿瘤诱导相似的血管变化以广泛适应新生血管形成。在上调的基因中，胰岛素受体(INSR)在肿瘤血管中的过表达被认为是一个有吸引力的治疗靶点。这些数据进一步支持了在肺癌和脑转移中靶向促血管生成途径的治疗策略。值得注意的是，肿瘤ECs中显著下调的基因与免疫激活相关(图3d)，与先前的发现一致，肿瘤ECs抑制免疫反应。
成纤维细胞亚聚类显示12个不同的聚类，分为7种已知的细胞类型，包括COL13A1+和COL14A1+基质成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞、间皮细胞、mBrain中的成纤维细胞样细胞和周细胞(图3e)。COL13A1+和COL14A1+基质成纤维细胞是正常肺(FB-C0、FB-C 6)和早期肿瘤(FB-C1、FB-C2)组织的主要成纤维细胞类型(图3f-g和附图5d-e)。相比之下，FB-C3中的肌成纤维细胞完全来源于肿瘤组织，包括tLung、tL/B和mLN样本。肌成纤维细胞被描述为癌症相关的纤维细胞，促进广泛的组织重建，血管生成和肿瘤发展。mLN中的肌成纤维细胞可能是成纤维细胞的网状细胞，有报道称它们是免疫特化的肌成纤维细胞，使用包裹的间充质将免疫细胞聚集到淋巴结中。mBrain中的成纤维细胞样细胞(FB-C7、CYP1B1+和APOD+)可能代表中枢神经系统(CNS)损伤后扩张CNS血管周围的细胞(图3f-g和附图5d-e)。肿瘤基质细胞(图3h)和肿瘤来源的EPCAM−CD45细胞(图3i-j)中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达证实了LUAD中肌成纤维细胞的浸润。并且观察到在正常组织的血管平滑肌细胞中部分α-SMA蛋白表达。结论，内皮细胞和成纤维细胞的细胞动力学说明基质细胞的表型转变，促进LUAD和远端转移中的组织重建和血管生成。
4. 髓样细胞启动免疫抑制微环境
髓样细胞在维持组织稳态和调节肺部炎症方面起着关键作用。图1b所示中42,245个髓样细胞的亚聚类显示为单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(图4a-b)。在我们的实验过程中，中性粒细胞没有被恢复。有两种类型的巨噬细胞存在于正常的成人肺中，包括高表达的MARCO、FABP4和MCEMP1基因的肺泡(AM)型，以及由循环单核细胞衍生的间质型。Mo-Macs与组织中巨噬细胞的功能不同，在肺纤维化过程中被招募并诱导表达促纤维化基因。我们在正常肺组织中主要检测到AM类型，包括抗炎AM (M−C1和M−C 6; APOE+,CD163+, C1QB+)，促炎症AM (M-C5; IL1B+和CXCL8+)，以及活跃循环的AM表达抗炎标志物(M-C13)。与此相反，mo-Macs内的肺肿瘤和远端转移组织被强烈富集。正常组织和肿瘤组织均包含S100A9+单核细胞(M-C3)或树突状细胞(DCs)。其余的聚类显示了特异性来源的异质性和不同巨噬细胞的特征，包括来自胸膜液(PE)的胸膜巨噬细胞(M-C8和9)或来自mBrain样本的小胶质细胞和巨噬细胞(M-C11)。胸膜巨噬细胞缺乏促炎症细胞因子基因的表达，如IL1B和CXCL8，但表达CD163转录本，这与非炎症表型相关。总的来说，我们的数据表明肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在原发肺肿瘤和远端转移中主要由mo-Macs传播，与组织中的巨噬细胞存在自身差异(图4c和附图6a-b)。
为了理解单核细胞向TAMs在转录上的转变，作者进行了无监督的轨迹分析，从肺或淋巴结样本中推断出巨噬细胞状态的变化(附图6c-d)。我们已经检测促炎症单核细胞随着时间轴向巨噬细胞的一系列转化，细胞失去其促炎症特性并获得抗炎症特征(附图6e-f)。在两种巨噬细胞亚群要么保留部分促炎症信号，要么偏向于抗炎症基因表达时，这种转变最终形成一个分支点。正常肺组织和肿瘤组织中分别富集了促炎症和抗炎症巨噬细胞。我们还在mLN中发现了抗炎巨噬细胞，且还有一个种群(LN-Mac-S6)表达巨噬细胞炎症因子(MIF、CXCL3和CCL20) (附图6f)。表达MIF的巨噬细胞也表达IL1B和TNF，与促炎症单核细胞中的水平相当，表明在mLN中有独特的巨噬细胞分布。
如图4b所示，DC聚类显示出标记基因表达的多样性，表明DC亚群存在异质性。为了更全面的分析，我们将DCs重新划分为六个亚组，包括CD1c+ DCs (朗格汉斯细胞, LCs)、CD141+ DCs、CD207+CD1a+ LCs、pDCs(血浆DCs)、CD163+CD14+ DCs、以及活化的DCs(图4d, e)。这在总髓样细胞群中细化了少量DC群(图4f)。有趣的是，在正常肺组织中很少发现pDCs，但在选定的肿瘤组织和转移淋巴结中发现(图4g-h)。pDCs显示了免疫抑制表型，上调白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)家族基因的表达、产生颗粒酶B (GZMB)和缺失CD86、CD83、CD80、激活LAMP3表达(图4i)。通过流式细胞术证实部分LUAD组织中存在pDCs(图4j-k和附图10)。因此，mo-Macs和pDCs都可以创造一个免疫抑制的微环境，这可能导致LUAD和远端转移的肿瘤抗原呈现不佳。
5. 适应性免疫的激活和紊乱
在NSCLC三级淋巴样结构中已经发现了肿瘤浸润B细胞。这些细胞介导抗肿瘤免疫反应，据报道与延长患者生存有关。与nLung样本相比，原发肿瘤中B细胞的相对比例增加(附图2c-d)。在淋巴结中，无论是否有转移，B细胞都大量存在。27,657个B细胞亚群显示14个聚类集中于5种分化状态(图5a)，分别为滤泡B细胞、表达免疫球蛋白γ(IgG)的血浆B细胞、表达IgA的粘膜相关淋巴组织衍生血浆B细胞、颗粒酶B分泌的B细胞以及生发中心(GC)B细胞(图5a和附图7a-b)。具体来说，将GC B细胞分为暗区细胞或亮区细胞，具有不同的转录程序，分别进行增殖或激活(附图7a)。其中，滤泡B细胞在所有样本中最为丰富(图5b和附图7c)。我们还观察到其他亚型的组织特异性的富集(附图7c-d)。首先，正常肺组织富含颗粒酶B分泌的毒性细胞，T细胞来源的IL-12调控其分化。这些细胞中颗粒酶B的分泌在介导细胞毒性方面发挥重要作用，可以替代T细胞。其次，我们在原发肿瘤和淋巴结转移中分别发现了比正常肺和淋巴结更多的GC B细胞。这些数据强烈提示在一些LUAD患者中存在高度激活的体液免疫反应。每种B细胞亚型均表现出略有不同的B细胞受体或Ig轻链可变基因表达谱(附图7e)，说明肿瘤抗原特异性B细胞的产生和克隆扩增。
T淋巴细胞是介导抗肿瘤免疫的核心细胞，是免疫检查点治疗的靶点。对于T淋巴细胞的亚聚类分析，我们首先从T和NK细胞群中收集了91,227个具有共同转录特征的细胞(图1b)，并利用标记基因表达进行二次细胞筛选，最终确定了64,403个T/NK细胞。T/NK细胞亚群反映了异质细胞谱系和功能状态，被鉴定为CD8+ T细胞(幼稚型、效应型、衰竭型)、幼稚型CD4+ T细胞、衰竭型T滤泡辅助细胞、T辅助细胞、调节性T细胞和NK细胞(图5c和附图8a)。根据之前的研究结果，我们发现与正常组织相比，肿瘤原发组织中耗竭了NK细胞和出现了调节性T细胞(Tregs) (图5d和图8b-c)。Treg细胞持续存在于tL/B、mLN和mBrain中，在肿瘤发展和转移过程中传递抗肿瘤免疫的抑制机制。CD8+ T细胞在转录轨迹中表现出与幼稚期、细胞毒性或衰竭状态相同的动态功能谱(图5e, f)。衰竭的CD8+ T细胞主要收集自肿瘤组织(tLung、tL/B、mLN和mBrain)，而细胞毒性效应细胞CD8+ T细胞收集自nLung(图5g)。幼稚型CD8+ T细胞主要来源于nLN和PE。T/NK细胞亚群在原发肿瘤和正常肺组织间的动态差异进一步通过流式细胞技术得到了确认(图5h和附图10)。综上所述，T细胞的细胞组成和基因表达表型的变化证实了肿瘤免疫在LUAD中向免疫抑制的方向发展。
6. 细胞间和分子间相互作用的推论
通过对40个免疫细胞亚群和间质细胞亚群的不同组织分布进行卡方检验，进一步证实了LUAD进展过程中的细胞动力学(图6a)。肿瘤特异性群体，如mo-Macs、pDCs、Tregs、肌成纤维细胞和肿瘤ECs在原发肿瘤和远端转移中广泛分布，而起源特异性的免疫细胞亚群和基质细胞亚群(肺泡细胞群、胸膜细胞群、小胶质细胞/细胞群和FB样细胞群)与它们相应的组织位置有明确的相关性。在LUAD发展和转移过程中，衰竭的CD8+ T细胞和mo-Macs细胞的比例显著增加(图6b)。此外，这两个亚群在肿瘤微环境中的增加与高肿瘤突变负担(TMB)相关(图6c)。由于高TMB是免疫检查点治疗成功的主要预测因子，我们的研究结果支持mo-Macs和衰竭CD8+ T细胞在晚期LUAD免疫检查点治疗成功应用中的作用。
为了阐明细胞间关系背后的分子关联，作者首先利用潜在的受体-配体配对相互作用构建了一个细胞通信网络。在tLung中，我们证实了tS2之间的主要串扰，是一种与LUAD发展和转移相关的新型癌细胞状态，是髓样细胞或基质细胞类型(图6d和附图9)。在该网络中，预测到tS2细胞和mo-Macs细胞之间的相互作用最为显著，而mo-Macs细胞和衰竭CD8+ T细胞之间的相互作用是免疫细胞网络中最显著的。mo-Macs和衰竭CD8+ T细胞的比例也与tS2癌细胞的增加呈正相关(图6e)。对于其他类型的细胞，我们发现tS2/恶性细胞和肿瘤ECs之间通过血管生成信号分子的潜在相互作用，如VEGF-VEGFRs和ephrin-Eph受体(图7a-b)。肿瘤ECs通过VEGF及其受体FLT1/VEGFR1、KDR/VEGFR2接收mo-Mac/恶性细胞的血管生成刺激信号，对肿瘤的所有阶段样本或脑转移样本而言，它可以作为血管生成的关键介质。
此外，作者预测了mo-Macs、衰竭CD8+ T细胞与原发肿瘤(tLung和tL/B)或远端转移瘤(mLN和mBrain)中癌细胞之间的分子相互作用，这些细胞在LUAD中占主导地位(图7c)。mo-Macs与tS2/恶性细胞之间的大多数配体-受体配对都参与了生长因子的信号传递，比如所有阶段样本的VEGFA和VEGFB。恶性细胞通过转移淋巴结中TNFR (TNFTNFRSF1A)、TGFBR (TGFB1-TGFBR2)和EGFR (EREG-EGFR)而接受mo-Macs的激活信号。TNFR信号在晚期tL/B中也表现突出。反过来，来自转移淋巴结的恶性细胞将向mo-Macs提供生长信号(CSF1-CSF1R)。潜在的信号转导对大部分衰竭CD8+ T细胞有抑制作用，tS2/恶性细胞对所有肿瘤分期的样本(NECTIN2-TIGIT)或转移性淋巴结(LGALS9-HAVCR2)都传递信号转导。有趣的是，mo-Macs可以传递同时激活(TNF-TNFRSF1B/ICOS)和抑制(LGALS9-HAVCR2)信号给衰竭CD8+ T细胞。因此，我们的研究结果证明了mo-Macs在LUAD中的复杂性，它极大地影响了T细胞平衡免疫激活和衰竭的功能。综上所述，细胞间的相互作用表明免疫细胞动力学和肿瘤细胞分子特征之间的密切关系，这可能决定了LUAD的预后和治疗效果。
结论
总之，这些结果说明了一个复杂的生物学蓝图，但也提出了除其他T细胞群外的一个靶向mo-Macs的治疗策略，转向免疫激活的方向。
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