编译：怀瑾，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
中枢神经系统B细胞在多发性硬化症（MS）中具有多种潜在作用：分泌促炎性细胞因子和趋化因子，呈递自身抗原给T细胞，产生病原性抗体以及引发脱髓鞘病毒的宿主。对研究这些功能，对患有复发缓解型患者（RRMS）、其他神经系统疾病（ONDs）和健康对照者(HCs)的脑脊液（CSF）和血液进行单细胞RNA测序（scRNA-Seq）。对其中部分患者以及其他RRMS、临床孤立综合征和OND受试者进行单细胞免疫球蛋白测序（scIg-Seq）。结果表明，核因子κB（NF-κB）和胆固醇的生物合成途径被激活，并且在CSF中记忆B细胞特定的细胞因子和趋化因子受体被上调，成浆细胞/浆细胞中SMAD /TGF-β1信号下调。克隆扩增、体细胞高频突变的IgM +和IgG1 + CSF B细胞与炎症、血脑屏障破坏和鞘内Ig合成有关。尽管MS患者中记忆B细胞和浆母细胞/浆细胞具有高度相似的Ig重链序列，但OND和HCs也存在相似性。同时，在患者样本中未检测到病毒（包括疱疹病毒）转录本。简言之，本研究认为在MS患者中，CSF B细胞趋向于炎症性和克隆扩展性记忆以及浆母细胞/浆细胞表型发展。
原名：A pathogenic and clonally expanded B cell transcriptome in active multiple sclerosis
译名：活动性多发性硬化症的致病性克隆性B细胞转录组
期刊：Proc Natl Acad Sci U S A
IF：9.58
发表时间：2020.8
通讯作者：Michael R Wilson
通讯作者单位：加州大学威尔神经科学研究所
DOI号：10.1073/pnas.2008523117
在整个scRNA-Seq和scIg-Seq分析中，共有24名受试者入组（n = 16 RRMS，3 OND，3 HC，2 CIS）。scRNA-Seq进行基因表达分析了12个RRMS（从5'开始的n = 10，从3'开始的n = 2），1个OND和3个HCs。配对的scIg-Seq分析上述部分患者（七个RRMS，一个OND，三个HC）和两个其他RRMS受试者。B细胞克隆连接分析涵盖了所有可用的受试者（n = 14 RRMS，n = 3 OND，n = 2 CIS和n = 3 HC）。基于10x Genomics 3'和5'文库制备试剂盒获得测序文库。七个未接受过治疗的RRMS受试者进行大规模RNA-Seq分析，确定了七个受试者CSF和血液中B细胞亚群分布。主成分分析表明B细胞主要基于其亚型和存在的部位聚类。
1.T细胞和髓样细胞决定脑脊液免疫微环境，RRMS患者B细胞异常富集研究者分析了10位RRMS受试者配对的血液和CSF的5'scRNA-Seq文库，利用无监督的Seurat聚类确定了典型的免疫细胞标记物的表达（图2B）。为了确定细胞间的关系，基于UMAP确定不同的细胞类型（图2C和D），同时发现MS患者的血液及脑脊液中髓样和淋巴样细胞群差异显著，这与以前的报道一致。RRMS患者和HCs中均存在CSF巨噬细胞（也称小胶质细胞样或CSF小胶质细胞）。RRMS患者CSF与血液细胞类型明显的差异（图2E）。与HCs相比，RRMS患者的CSF B细胞富集高达13倍（图2F）。
2.整合转录组分析显示RRMS患者CSF记忆细胞和浆母细胞/浆细胞具有不同的变化基于5'和3'scRNA-Seq数据集，研究者明确了三种B细胞亚型：原始，记忆和浆母细胞/浆细胞（图3A）。原始和记忆B细胞聚集在UMAP空间具有转录的连续性（图3B）。大规模（流式细胞仪）和单细胞分析均显示CSF中记忆B细胞和浆母细胞/浆细胞的比例高于外周血（图3C）。CSF和血液的转换记忆B细胞（SM B细胞）中共有294个基因差异表达，其中166个基因在CSF中上调。与外周相比，CSF SM B细胞上调CD138和CD83，并下调CD52，CD180，CD53，CD22和CD48。另外，CSF SM B细胞上调了IL10RA，IL2RB，TGFB1，TBX21，CXCR3，CXCR4，CCR2和CCR5。涉及18个显著的上游调节因子，包括膜受体TREM1和NF-kB复合体，都被激活（图3E）。CEBPB 作为NF-κB途径下游的转录调节因子也被激活，暗示经典的NF-κB通路被活化。趋化因子CCL2和CCL11预测均被激活。IPA分析显示59个基因网有显著性，其中50个被预测已激活。CSF SM B细胞中炎性基因富集。同样的，clusterProfiler富集分析揭示与胆固醇代谢和生物合成相关的基因富集（图3D）。血液SM B细胞中与转录、翻译和分解代谢的相关基因也被富集。脑脊液和血液的USM B细胞中共有228个基因差异表达。，CSF中有96个被上调。CSF USM B细胞上调CD83，IL10RA，CXCR4和TGFB1，下调CD180，CD52和CD27。IPA网络分析预测五个上游调节因子被激活，包括TREM-1和NF-κB。三十四个起主要作用的调节因子，预测其中有29个被激活，包括IL3，IL6，IL7，IL32，OSM，TSLP和CXCL8。只有一个GO基因集在 CSF USM B细胞中富集，即“骨骼肌发育”相关基因。与转录，翻译和分解代谢相关的基因集在血液USM B细胞中富集。在CSF B细胞亚群USM和SM中 “ EIF2信号”通路均被抑制。研究者进一步比较大规模RNA-Seq数据与scRNASeq数据。在3'和5'单细胞基因表达数据库中，CSF和血液中记忆B细胞分别有1,231和1,221个基因差异表达。其中430个（CSF中59个上调）在3'和5'数据集中均差异表达。与外周血相比，CSF记忆B细胞上调CXCR4和CD70，并下调CD180，CD22，CD27，CD37，CD40，CD52，CD53，CD72，CD74，CD79A和CD79B。八个上游调节因子（PRDM1，NR4A1和MAPK1被激活；STK11，PAX5，PML，PPARA和PPARGC1A被抑制）有显著性。预测TREM1，NF-κB复合体和RELA在内的七个上游调节因子都将在CSF记忆B细胞的5'数据库中被激活。17个因果网（10个被激活，7个被抑制）在3'和5'数据集中均具有显著性；11个因果网（包括CXCL8）与大规模RNA-Seq数据具有重合性。此外，途径（5'数据集）和GO（3'和5'数据集）分析表明，CSF记忆B细胞中的胆固醇生物合成被激活。外周血记忆B细胞中与抗原加工相关的基因集（如“肽抗原结合”和“ MHC II类蛋白复合物结合”）被富集。2.3 CSF中CD27hi浆母细胞 /浆细胞具有炎症表型并下调TGF-β1通路相关基因在CSF和外周血浆母细胞/浆细胞之间共有204个基因（63种在CSF中上调）差异表达。CSF成浆细胞/浆细胞上调CD138，CD74，CD79A，CD46和BCR，相关的基因包括IL21R，UBA7，TBX21，IL16，SOX5，CXCR4，CXCR3和CCR5（图3F）。CSF浆母细胞/浆细胞富含炎症相关GO基因集，包括“细胞因子受体活化”，“趋化因子受体活化”和“ G蛋白偶联趋化因子受体活化”以及与胆固醇生物合成。同样，clusterProfiler分析显示与脂肪酸生物合成和炎症有关的基因集富集。在CSF浆母细胞/浆细胞中，与TGF-β1信号通路（BMPR1A，TOB1，JUN，SPTBN1）有关的“ SMAD蛋白入核”（对应SMAD蛋白信号转导）被下调。CSF浆母细胞/浆细胞表达的IL10RA并不高于外周血，但IPA分析显示三个上游调节因子均具有显著性，包括对IL4的抑制。在3'和5'scRNA-Seq数据库中，CSF和外周血浆母细胞/浆细胞之间分别有225和49个基因差异表达。其中有30个基因（在CSF中有10个上调）被共享，且在通路、预测的主调控因子或因果关系网上没有重叠。此外，大规模 RNA-Seq分析中具有显著性的三个重要上游调节子在单细胞数据集中并不显著。在3'基因表达数据集中，IL16在CSF浆母细胞/浆细胞中被上调。有趣的是，TGFB-1预测在5'基因表达数据集中被抑制；在CSF浆母细胞/浆细胞中对大规模RNA-Seq数据进行 clusterProfiler分析，也观察到了TGF-β1信号通路中基因的下调。对仅在两个数据集中差异表达的基因进行GO分析显示，与铁转运蛋白靶向和转运相关的基因丰富，而与胆固醇生物合成相关的未被富集。与大规模RNA-Seq分析相似，CSF及其对应外周血中浆母细胞/浆细胞的IL10RA表达没有差异。
3.配对的scRNA-Seq和scIg-Seq揭示与急性炎症和鞘内Ig合成相关的克隆扩增、体细胞高频突变的IgM和IgG1 CSF B细胞研究者利用5'scRNA-Seq数据库对RRMS受试者的成对CSF和外周血进行scIg-Seq全长分析，发现CSF和外周血的IgG1 + B细胞比例较高，而CSF中IgG1 +和IgM + B细胞比例大致相同（图4A）。大规模RNA-Seq数据中有类似的发现，IgM细胞主要在幼稚和USM亚群，而IgG1细胞主要在浆母细胞/浆细胞、SM和DN亚群（图4B）。研究者进一步探究上述发现是否与临床检查或患者的放射学特征相关。发现临床IgG指数与scRNA-Seq鉴定出的受试者CSF B细胞总数之间存在显著的线性相关性，而临床白细胞总数与CSF IgG指数之间的相关性较弱（图4C）。scRNA-Seq鉴定的 CSF克隆增殖的B细胞数量与CSF IgG指数之间存在更强的相关性（图4D）。此外，在 MRI钆增强的RRMS受试者中观察到CSF B细胞大量克隆扩增，且仅发生在CSF（图4E）。进一步研究CSF和血液中B细胞免疫谱的多样性。CSF中B细胞克隆扩增显示IgM +和IgG1 +细胞多样性受限（图4F）。进一步比较所有进行scIg-Seq的IgM +和IgG1 + RRMS B细胞，发现 CSF IgM + CDR序列置换突变频率增加（图4G）。CSF IgM +细胞的H-CDR3包含更多的碱性氨基酸残基，而且CDR3更长，从而支持这些细胞的抗原获取（图4G）。为了确定存在置换突变的IgM + B细胞的表型，研究者将scRNA-Seq和scIg-Seq结合一起分析CSF和血液IgM + B细胞，将它们分类为置换突变阴性（即种系）或置换突变阳性（例如经历体细胞高频突变[SHM]），以鉴别它们之间的差异表达基因。最能区分种系和SHM IgM + B细胞的基因以图3H所示。种系B细胞为TCL1A +，CD27-，TNFRSF13B-和GPR183-，支持它们作为初始B细胞的特性。SHM + IgM + B细胞是TCL1A-，CD27 +，GPR183 +和TNFRSF13B +，支持它们作为记忆B细胞的特性，其表型类似于先前描述的脾脏边缘区IgM + B细胞（图4H）。将种系IgM +和SHM + B细胞叠加到5'scRNA-Seq基因表达UMAP空间上时，SHM-细胞主要与初始B细胞聚类，而SHM +细胞主要与记忆B细胞聚类（图4B和4I）。此外还鉴定了HC CSF中的三个IgM + SHM + B细胞，表明它们在中枢神经系统中的存在并不一定意味着患病状态。
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