科研 |Nature：髓系细胞中C9orf72抑制STING诱导的炎症
编译：Carota，编辑：景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)在临床表现、病理和遗传有很多共同点，并且这两种疾病种也都伴随着自身免疫性紊乱。C9orf72基因突变导致蛋白表达降低，大脑和外周血细胞重复突变的RNA和双肽增加累积。本研究完全敲除了小鼠髓系细胞中的C9orf72，进而发现小鼠表现出年龄依赖性淋巴细胞肥大和自身炎症，从C9orf72−/−小鼠中分离出来的树突状细胞显示I型干扰素反应早期激活，而C9orf72−/−髓系细胞对干扰素基因(STING)蛋白刺激因子过度激活，同时自身溶酶体途径对STING的降解减弱，激活了C9orf72−/−免疫细胞中的I型干扰素反应，造成了脾肿大和炎症。此外，还发现缺少一个或两个C9orf72基因拷贝的小鼠更容易患自身免疫性脑炎，这与C9-ALS/FTD患者对自身免疫性病的易感性相似，通过STING抑制剂可以降低I型干扰素。结果表明，C9-ALS/FTD患者由于C9orf72蛋白水平降低无法抑制由STING介导的I型干扰素炎症反应最终导致免疫失调。
论文ID
原名：C9orf72 in myeloid cells suppresses STING-induced inflammation
译名：髓系细胞中C9orf72抑制STING诱导的炎症
期刊：Nature
IF：42.778
发表时间：2020年8月
通讯作者：Robert H. Baloh
通讯作者单位：美国洛杉矶西达赛奈医学中心
DOI号：10.1038/s41586-020-2625-x
实验设计
结果
C9orf72敲除小鼠表现出淋巴器官增生和年龄相关性全身炎症。研究者发现C9orf72−/−小鼠在8周时出现有轻微炎症和淋巴样增生，在8个月时出现明显的全身炎症。DC亚型在C9orf72−/−小鼠中发育正常，随着年龄的增长CD11b DC细胞上共刺激分子CD86的表达增加（图1. a, b）。C9orf72−/−小鼠胸腺中的T细胞发育正常，但是记忆和效应记忆CD4和CD8 T细胞的数量甚至在8周时就增加了，并且随着年龄的增长变得更加明显(图1.c, d)。
考虑到C9orf72在淋巴细胞中表达水平较低， 研究者将C9orf72fl/fl小鼠分别与Cx3cr1Cre和LysMCre小鼠进行杂交，以确定其髓系细胞的特有表型。C9orf72fl/fl小鼠体内中髓系群体(包括单核细胞、组织巨噬细胞和DCs13) C9orf72缺失；Cx3cr1Cre小鼠完全再现了脾肿大、DCs中共刺激分子表达的改变以及C9orf72完全敲除小鼠中可见的T细胞激活（图1.e），同样的现象也可以在C9orf72fl/fl；LyzMCre小鼠中观察到，同时可能因为LyzMCre在DC中表达的较少(小于10%)，而Cx3cr1Cre表达超过90%，因此LyzMCre表现程度较轻。为了进一步探索适应性免疫细胞的非细胞自主表型，研究对对照、C9orf72−/−和C9orf72fl/fl;Cx3cr1Cre小鼠的脾细胞群进行了分类测序。对C9orf72fl/fl；Cx3cr1Cre小鼠的CD4和CD8 T细胞的通路分析显示I型干扰素信号的选择性上调，表明CD4和CD8 T细胞受到髓系细胞产生的I型干扰素反应的刺激（图1.g-i）。
图1. 幼龄和高龄C9orf72−/−小鼠DC发育和T细胞激活。a, b ：CD86在幼龄和高龄CD11c+脾DCs中的平均荧光强度(MFI) (a;n = 5, b;n = 6)；c,d：8周龄CD8 T细胞(c;n = 5)和8个月大 (d;n = 6)小鼠原始(CD62L+)、记忆(CD62L+CD44+)和效应记忆CD4 T和CD8 T细胞的流式细胞分析；e：左，C9orf72-Cx3cr1Cre小鼠5个月时脾肿大的大体图像。右，脾脏重量； f：C9orf72-Cx3cr1Cre小鼠幼稚CD4和CD8 T细胞数量减少，CD4记忆T细胞和CD8效应记忆T细胞数量增加(n = 7)； g：GSEA检测C9orf72-Cx3cr1Cre小鼠CD8 T细胞和CD4 T细胞中显著上调的信号通路 (错误发现率(FDR)小于0.05)(n = 4)；h, i： RNA-seq的转录量(TPM)值，显示CD8(野生型，n = 4;C9−/−，n = 3;Cx3CR1Cre, n = 3)和CD4 T细胞(野生型，n = 4;C9−/−，n = 3;Cx3CR1Cre, n = 4)中ISGs升高。
2 STING信号通过阻断自噬途径导致I型干扰素反应和炎症的持续激活
为了确定C9orf72缺失的DCs激活适应性免疫细胞的因素，研究者对野生型和C9orf72−/−小鼠的脾classical DCs进行了RNA测序(RNA-seq)。 主成分分析(PCA)显示两种基因型分布不同，多种炎症细胞因子在C9orf72−/−DCs中高表达，包括白介素IL-6，IL-10、IL-12β。用分层聚类进行的热图分析证实，四只小鼠中有三只的C9orf72−/− DCs中的典型I型干扰素应答基因显著上调，而NF-κB信号无显著差异（图2.a, b）。
为了确定I型干扰素反应过度活跃的潜在驱动因素，研究者使用几种激动剂 toll样受体(TLRs)和胞质受体刺激野生型和C9orf72−/−骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)。TLR3、TLR4和TLR7信号触发了干扰素IFN-β的产生。然而与野生型BMDMs相比，在C9orf72−/−BMDMs中使用cGAS -STING通路的激动剂可IFNβ和干扰素刺激基因(ISGs)表达更加过度活跃(图2.c-e)。
STING信号通过溶酶体阻断自噬导致I型干扰素反应和炎症的持续激活，鉴于C9orf72参与核内体运输、自噬和溶酶体功能。研究者假设：C9orf72−/−细胞中STING降解被抑制，进而观察到C9orf72-/-BMDMs受到 cGAMP刺激后，STING的降解延迟，并且STING在365丝氨酸上的磷酸化持续存在(图2.f, g)，这表明STING通过干扰素调节因子3 (IRF3)促进干扰素持续激活。在C9orf72-/-BMDMs中LC3-II的基础水平与对照组相比表达量明显增加，并且在C9orf72−/−BMDMs中观察到cGAMP激活STING 进而诱导LC3-II脂化进一步增加(图2. h)。这一差异通过自噬抑制剂巴菲霉素A1的处理得以正常化，表明其部分原因是C9orf72缺陷细胞中LC3-II溶酶体降解降低所致(图2.h)。这些数据建立了一个模型，在该模型中，通过自噬减少溶酶体对STING的降解导致晚期核内体中STING水平的增加，这可以作为持续干扰素诱导的平台。支持这一观点的是，cGAMP诱导C9orf72 BMDMs过度活跃的IFN可以被STING拮抗剂完全阻断(图2.i)。为了进一步确定C9orf72−/−小鼠I型干扰素信号升高是由STING在体内驱动的，研究者对C9orf72−/−小鼠和STINGgt/gt小鼠进行交配，比较发现比起STINGgt/gt 小鼠，C9orf72−/−小鼠脾肿大和髓细胞激活状态都得到了缓解(图2.j, k)。为了进一步描述C9orf72−/−小鼠脾肿大和髓细胞激活状态得到缓解的特征，随后研究者对野生型、 C9orf72−/−和C9orf72−/−、STINGgt/gt小鼠的脾脏细胞进行RNA-seq，分离的脾脏CD11b髓细胞、B细胞、CD4和CD8 T细胞中I型干扰素升高反应被STING的降低完全解除（图2. l）。C9orf72−/−、STINGgt/gt小鼠全身炎症表型并没有完全解除可能是由于STING缺失本身促进TLR信号过活跃和炎症反应，或者是因为C9orf72也可以调节与非STING相关的通路。无论如何，这些发现支持了在C9orf72−/−骨髓细胞增加STING活动促进了I型干扰素缓慢升高，这是C9orf72−/−小鼠系统性自身炎症的关键部分。
图2. 髓系细胞中C9orf72的丢失通过STING导致I型干扰素的增加。a, b：干扰素相关基因和NF-kB相关基因表达热图；c-e, qRT-PCR 分析野生型和C9−/−小鼠受到cGAMP刺激后BMDMs中的Ifnb1 (c)、Mx1 (d)和Cxcl10 (e)的表达情况；f：对cGAMP刺激0、6、9、24、小时或bafilomycin (Baf)刺激24小时的BMDMs进行Western blot分析，结果显示与野生型细胞相比，C9−/−的STING降解延迟；g：左，STING磷酸化 (pSTING，丝氨酸365磷酸化)的western blot分析，右，从n = 3个生物重复实验中量化pSTING；h：cGAMP刺激BMDMs 0、6、24、24小时或者在bafilomycin作用24小时的Western blot分析显示LC3-II表达.；i：使用cGAMP刺激6小时后，qRT-PCR分析野生型和C9−/− BMDMs中Ifnb1的表达情况；j左侧，8-10周(n = 7)时脾脏重量(毫克)标准化为体重(克)；右侧，粗略的代表性图像；k： qRT-PCR分析野生型(n = 6)、STING 缺失（Gt−/−；n=3）, C9−/−(n = 5)和C9−/−：Gt−/−(n = 6)小鼠的脾细胞中的Trem2和IL10；L：3月龄野生型(n = 4), C9−/−(n = 3)和C9−/−/Gt−/−(n = 4)小鼠脾脏CD11b细胞ISG表达的RNA-seq分析。
3 C9orf72−/−小鼠免疫表型改变导致自身免疫性疾病的易感性增强、抗肿瘤免疫增强
观察到IL-12β在C9orf72−/−DCs中的高表达，其与IFNα/β相结合，可以促进T细胞向TH1表型分化，为了支持这一点，研究者发现IL-2和IFN的表达在受刺激的C9orf72−/−小鼠脾中增加并且表现出TH1表型的标记。IL-17的表达也呈显著升高趋势，IL-17的表达促进了TH17细胞的生成，进一步说明C9orf72−/−小鼠的慢性STING/ I型干扰素激活对适应性免疫细胞的刺激导致了自身免疫性疾病的倾向。
因此，研究者分析了C9orf72−/−小鼠是否更容易患自身免疫性脑炎（EAE）。观察到，在缺乏C9orf72一个或两个拷贝的小鼠中，临床严重程度和脊髓炎症呈分级的基因剂量依赖性增加（图3. a, b）。杂合子小鼠对EAE敏感性的增加有重要意义，因为C9orf72的表达只在重复扩张载体组织中部分丢失，因此环境应激源的刺激是必要的。这支持了STING在DC 中慢性活化促进TH1偏向T细胞表型分化，TH1偏向T细胞在EAE过程中浸润神经系统，导致炎症反应增强。值得注意的是，髓系细胞慢性激活STING和C9orf72−/−小鼠中适应性免疫细胞的激活不同于EAE中急性激活STING，后者通过直接促进T细胞调节反应和抑制TH1反应来减轻严重程度。
有趣的是，研究也表明ALS患者中各种癌症的发生频率发生了改变。DCs在维持免疫系统的稳定中起着核心作用，自身免疫的倾向也与增强的抗肿瘤免疫能力有关. 因此，研究者检查了抗肿瘤免疫模型 C9orf72−/−小鼠，测量静脉注射小鼠B16黑色素瘤细胞后的肿瘤负荷。观察到C9orf72在肺中的B16黑色素瘤肿瘤负荷中呈剂量依赖下降，缺少一个或两个C9orf72拷贝的小鼠比野生型小鼠更耐受肿瘤(Fig. 3c–e)，这一反应伴随着B16接种后肺和脾脏中活化T细胞数量的增加。这些数据与之前的研究一致，表明STING是介导启动抗肿瘤CD8效应T细胞的关键。类似地， STING型干扰素对C9orf72−/−DCs肿瘤来源DNA的反应更有效地驱动细胞毒性抗肿瘤T细胞。总之，这些发现表明，在C9orf72−/−小鼠中观察到的免疫表型改变(或在C9orf72丢失一个副本之后)导致自身免疫性疾病的易感性增强和抗肿瘤免疫增强。
图 3. C9orf72−/−小鼠对EAE更敏感，与野生型小鼠相比，抗肿瘤免疫能力增强。a,b： 野生型(n = 13)， C9+/−(n = 13)和C9−/−(n = 10)小鼠EAE过程中的临床评分(a)和体重(b)；c：野生型、C9+/−和C9−/−小鼠接种B16黑色素瘤14天后的代表性肺图像；d, e： C9−/−小鼠的肿瘤集落数量减少(d;野生型，n = 8; C9+/−，n = 8;C9−/−，n = 9)，接种B16黑色素瘤细胞14天后黑色素含量降低 (e;野生型，n = 6;C9+/−，n = 8;C9−/−，n = 9)。
4 C9-ALS/FTD患者具有I型干扰素信号过度活跃的免疫失调表型
研究者使用RNA-seq检测了正常对照组、散发性ALS患者和C9-ALS患者的血液单核细胞来源巨噬细胞(MDMs)，评估C9orf72重复扩增的髓系细胞中是否存在类似的免疫表型改变。基因集富集分析(GSEA)显示，C9-ALS MDMs与散发性相比， IFNα/β信号通路相关的通路显著上调，与C9orf72−/−小鼠免疫细胞中发现的上调通路几乎相同（图4.a-c；图1.g）。此外，研究者通过外部验证集证实了先前报道的C9orf72在C9-ALS携带者中的低表达(图4. d)，观察到C9-ALS患者相较于散发性ALS患者I型干扰素信号显著上调(图4. e)。
为了评估这种基因型驱动的炎症特征是否存在于神经组织中，研究者分析了之前发表的ALS患者RNA-seq数据集。再次观察到C9-ALS患者相较于散发性ALS患者小脑C9orf72表达水平降低和I型干扰素反应上调(图4. f)。为了确定I型干扰素信号是否来自小胶质细胞，研究者检测了cGAMP刺激后分离的小胶质细胞产生的IFNβ，观察到STING激活状态类似于C9orf72−/−小鼠外周血巨噬细胞(图4.g)。最后，为了确定在C9-ALS骨髓细胞中观察到的I型干扰素信号升高是否由STING驱动，用STING抑制剂处理了患者外周血单核细胞(PBMCs)或MDMs,观察到STING抑制剂 H151没有改变散发性ALS患者外周血细胞中ISG的基本表达，但在C9-ALS中持续抑制ISG的表达(图4.h)。通过对C9-ALS患者的经H151治疗的MDMs进行RNA序列分析，观察到ISGs的广泛抑制(图4. i)。这些发现有力地支持了C9-ALS/FTD患者具有基因决定的免疫表型的观点，其特征是I型干扰素信号过度活跃，其中部分是由STING激活驱动的。
图 4.肌萎缩性侧索硬化症中C9orf72重复扩增患者外周血髓细胞中I型干扰素信号增强，可被STING拮抗剂抑制。 a：C9-ALS患者(n = 5)和散发性ALS患者(n = 5) MDMs的GSEA (FDR小于0.05)；b：C9-ALS,散发性肌萎缩侧索硬化症和正常对照组(n = 5)MDMs中I型干扰素刺激基因表达值；c, b：中干扰素刺激基因的qRT-PCR验证(n = 3)；d：遗传C9-ALS患者的RNA-seq (n = 20)显示C9orf72表达低于散发性ALS患者(n = 259)； e：C9-ALS患者与散发性ALS患者全血RNA-seq中上调的通路：f：C9-ALS患者(8例)与散发性ALS患者(10例)小脑组织炎症通路上调；g：qRT-PCR分析野生型(n = 4)和C9−/−(n = 4)小鼠大脑中分离的小胶质细胞在cGAMP刺激后产生IFNβ蛋白； h：对散发性ALS和C9-ALS患者有无STING抑制剂H151治疗的PBMCs中MX1和STAT1的ISG mRNA进行qRT-PCR分析；i：H151治疗和未治疗的两名C9orf72患者的MDMs的RNA-seq显示干扰素刺激基因表达值，蓝色表示百分比下降;红色表示百分比增加。
结论
更多推荐
1 高分综述 | Trends in Biotechnology: 单细胞分辨率下利用空间转录组揭示器官分子结构（国人佳作）
END