编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
肥胖是包括肝癌（HCC）在内恶性肿瘤的独立危险因素。然而产妇肥胖是否影响后代肝癌的发生尚不明确。因此，研究者旨在探究这一关联和潜在的机制。在HFD的胁迫下，母系肥胖导致后代对DEN诱导HCC的敏感并且这一敏感性传代累积。研究者确定了miR-27a-3p的两个直接靶基因Acsl1和Aldh2，在传代中逐步改变。在高脂血症的条件下，Acsl1和Aldh2的下调促进了体外细胞的增殖或者体内细胞的生长。在瘤内注射miR-27a-3p模拟物通过负调控Acsl1和Aldh2加速肿瘤细胞生长，而瘤内注射miR-27a-3p抑制剂具有相反的效果。此外，血清中的miR-27a-3p在HFD膳食的母系中传代逐步增加。在孕期小鼠中注射miR-27a-3p模拟物不仅使肝脏中的miR-27a-3p升高、使后代中的Acsl1/Aldh2负调控，还能加速DEN处理后代中HCC的发展。TCGA分析人类HCC中，上调的miR-27a-3p以及下调的Acsl1/ Aldh2与存活负相关，而在肥胖/非肥胖肝脏中肿瘤/非肿瘤组织中，肝脏的miR-27a-3p与Acsl1/ Aldh2的表达负相关。母系肥胖通过miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2轴调节后代对肝癌的累积易感性。在这项研究中，我们发现了一种microRNA（miR-27a-3p），它在肥胖母亲中表达上调，并可以遗传给后代。这种microRNA通过调节2个基因（Acsl1和Aldh2）增加了后代患肝癌的风险。这种机制可能成为未来的治疗靶点。
原 名：Multigenerational maternal obesity increases the incidence of HCC in offspring via miR-27a-3p
译 名：多代孕产妇肥胖症通过miR-27a-3p增加了后代HCC的发生率
期 刊：Journal of Hepatology
影响因子：20.582
发表时间：2020年4月15日
作 者：Ling Zheng
单 位：武汉大学
DOI：10.1016/j.jhep.2020.03.050.
三分之一的人群是超重或者肥胖的；流行病学研究提示肥胖是包括结肠癌、乳腺癌和肝癌等肿瘤的独立危险因素。例如，肥胖能够促使肝癌以1.5-4倍的速度发展；研究者对900000美国人进行16年的研究发现在肥胖男士和肥胖女士肝癌的发生率分别是非肥胖个体的4.52-和1.68倍。近期在美国，高达50%被诊断为HCC的个体是由于肝代谢紊乱引起的，如非酒精性脂肪肝（NAFLD）。母系肥胖直接影响后代的健康，对肥胖流行病和代谢疾病的发展发挥重要作用。研究表明肥胖母亲产下的后代发展为代谢疾病的风险升高，包括NAFLD，却与父亲的体重无关，提示母系因素在肥胖遗传中发挥主要作用。研究者之前证实暴露在高脂膳食（HFD）胁迫下的母亲，其产下的后代肥胖和NAFLD分值逐步升高。然而，是否肥胖母亲的后代更倾向于发展恶性肿瘤，例如HCC尚不清楚。表观遗传的机制参与多代的肥胖。越来越多的证据提示非编码RNAs能够在后代中调节可遗传的表型，例如母系循环中的miRNAs能够通过胎盘影响后代的表型。然而，母系非编码RNAs和后代疾病发展之间的关联尚未建立。
在这里研究者利用之前报道的模型研究了在HFD胁迫下肥胖母亲所产下的后代对DEN诱导HCC过程的敏感性。通过RNA-seq确定了后代肝脏中miRNAs和基因是多代变化的。此外，利用数据库和临床样本、肿瘤异体移植、细胞培养和小鼠模型，研究者确定了miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2轴在代际表观遗传的机制，阐释了该miRNA轴能够调节肥胖母亲所产下后代的HCC发生率。
与HFD1D和NCD组相比，HFD2D和HFD3D组的存活率显著降低，且两组没有更多的差异（图1A、B）。血清中TC和TG的水平在HFD1D 和HFD2D组中显著高于NCD和NC小鼠，且在HF3D组中显著升高（图1C），提示世代HFD压力逐步增加后代的脂肪毒性。研究者之前报道称持续的HFD胁迫导致后代体重的逐步增加。然而，在DEN诱导的HCC模型中，在多代HFD胁迫后子代的身体体重没有显著改变，可能是由于肿瘤相关的恶病质造成的。在HFD膳食和DEN压力组研究者发现脏脏的重量增加并且皮脂腺的现象。显著的是，肿瘤的数目和类型在HFD+DEN胁迫下的子代中逐步升高（图1D）。H&E和三色染色也证实在HFD+DEN胁迫下子代的肝脏病理逐步恶化（图1E、1F）。
图1 多代暴露在HFD压力下的母代产生的子代对HCC的易感性逐步增加
母系多代HFD暴露增加了子代在HFD和DEN挑战后肝脏的炎症和细胞增殖
免疫细胞的渗透增多以及肝脏细胞的增殖是HCC发展的重要特征。在HFD——DEN压力下逐步传代的子代中对肝脏细胞进行染色发现F4/80（巨噬细胞的标记物）、CD3（T细胞的标记物）、Ly-6G（嗜中性白细胞的标记物）以及Ki67（细胞增殖的标记物）数量增多（图2A-B）。肝脏损伤的标记物例如血清中的AST和ALT在传代的子代中也逐步增多（图2C）。同时血清中AFP的水平，一种HCC诊断的标记物在NCD、HFD1D、HFD2D组中逐步升高，并且在HFD3D中进一步升高（图2D）。血清中炎症标记物IL-6和TNFa28的水平在NCD小鼠中也身高并且进一步在HFD2D和HFD3D组中升高（图2D）。
图2 多代暴露在HFD压力下母代产生的子代肝脏炎症反应和增殖逐步升高
传代中代谢基因的改变
为了探究多代母系HFD暴露是否会升高子代在HFD+DEN胁迫下子代HCC的发生率，研究者对肿瘤细胞进行了RNA-seq。在不同组别(HFD1D vs. HFD3D, NCD vs.HFD3D, NCD vs. HFD1D, HFD1D vs. HFD2D, and HFD2D vs.HFD3D) 发现显著改变的miRNAs所富集的前10个KEGG信号通路大多参与代谢（图3A）。对代谢信号通路中富集的基因进行进一步分析发现这些大部分基因是下调的并且属于脂质/氨基酸代谢通路（图3B-C）。与RNA-seq结果一致的是qPCR证实在肿瘤中Aldh2, Acsl1, Apoa5,Apol7a, Rbp4, Akr1c6, Acaa2, Acaa1b, Glul, Car3, Hamp，Hamp2在HFD+DEN压力下的传代子代的肝脏中逐步升高（图3D）。同时。在非肿瘤部分发现了这些基因相似的改变图谱（图S3E），尽管这些基因在HFD2D 和HFD3D中显著改变而不是在HFD1D组中（图S3E）。鉴于Acsl1和Aldh2与TCGA分析中HCC显著负相关，研究者在这些基因中聚焦于Acsl1和Aldh2（图3E）。此外HCC患者较低的Acsl1和Aldh2水平具有更差的整体存活率（图3F）。此外Apoa5, Acaa2, Hamp的水平也与HCC负相关，而Apoa5和Hamp与存活率显著相关（图S4）。研究者因此检测了是否Acsl1和Aldh2在子代HCC发生率身高中发挥作用。
图3 传代产生的男性子代逐步改变基因的确定
Acsl1和Aldh2敲除协同促进HFD刺激下肿瘤生长
研究者单独或者同时敲除HepG2细胞中的Acsl1和Aldh2，在正常或者PA处理的条件下，MTT和克隆形成实验都说明在单独或者同时敲除Acsl1和Aldh2细胞增殖增加。有趣的是，在PA处理下，Acsl1和Aldh2同时敲除能够显著引起细胞增殖，提示在高脂血症条件下Acsl1和Aldh2协同影响细胞增殖。为了探究是否Acsl1和Aldh2的敲除能够激化肿瘤细胞在体内的生长，研究者进行了皮下异种移植，研究者构建了稳转表达shAcsl1、或者shAldh2、或者shAcsl1+shAldh2的HepG2细胞，在异种移植注射之前，将裸鼠进行8周的NC或者HFD喂养，结果发现身体的体重、血清TC和TG水平在HFD喂养的小鼠中显著升高（图4A）。与对照组相比，NC喂养条件下的肿瘤生长率和体重在shAcsl1, shAldh2和shAcsl1+shAldh2组中显著升高（图4B-D）。然而与CT组相比，在HFD喂养条件下肿瘤的生长率和体重在shAcsl1或者shAldh2升高，在shAcsl1+shAldh2组中进一步升高（图4B-D），重要的是，与NC组相比，HFD组肿瘤生长率和体重都显著升高（图4B-D）。
图4 在肿瘤异体移植实验中敲除Acsl1和Aldh2促进细胞增殖
传代中肝脏miRNAs改变
研究者将子代肝脏中的miRNAs也通过RNA-seq进行了检测。在不同的组别(HFD1Dvs. HFD3D, NCD vs. HFD3D, NCD vs. HFD1D, HFD1D vs. HFD2D,HFD2D vs. HFD3D)中发现显著改变的miRNAs所富集的前10个KEGG信号通路大多参与肿瘤的发展（图5A）。热图显示了miRNAs在传代中逐步改变（图5B）。与RNA-seq结果一致的是qPCR结果证实在肿瘤中miR-210-3p, miR-223-3p, miR-222-5p, miR-322-5p, miR-34c-5p,miR-27a-3p, miR-21a-5p, miR-486a-5p以及miR-532-5p在子代中逐步升高（图5C）。同时，在非癌组织中这些miRNA中也发现了低水平改变。TCGA分析提示在HCC患者中包括miR-27a-3p在内的5种miRNAs中存活率显著降低（图5D）。
图5 在多代产生男性子代肿瘤内miRNAs逐步确定
MiRNAs水平的升高与靶基因的表达降低相关。生信分析提示miR-27a-3p可能调节Acsl1和Aldh2的转录（图S8A-B）。利用miR-27a-3p的模拟物或者抑制剂处理HepG2或者Hepa1-6细胞以调节miR-27a-3p的水平（图6A）。在模拟物处理后Acsl1和Aldh2的mRNA和蛋白水平显著降低，而在抑制剂处理后显著升高（图6A-B）。为了检测miR-27a-3p是否能够调节Acsl1或者Aldh2 mRNAs的转录，研究者进行了荧光报告基因实验。将miR-27a-3p模拟物与WT型共转染发现转录水平显著降低，而抑制剂具有相反的效应（图6C）。为了进一步探究miR-27a-3p在肿瘤生长上的影响，研究者进行了皮下异种移植。将裸鼠进行8周的HFD喂养后皮下注射HepG2细胞(day 0)，随后将miR-27a-3p agomir每隔一天一次注射到肿瘤内（从6-16/18天）（图6D），结果发现肿瘤的生长率和体积显著升高（图6D-E）。agomir注射显著上调miR-27a-3p以及肿瘤内Acsl1/Aldh2的mRNA和蛋白水平的下调（图6F）。与此一致的是，在NC或者HFD条件下miR-27a-3p抑制剂在肿瘤生长率和体积具有相反的效应（图6G-H）。MiR-27a-3p抑制剂在肿瘤内Acsl1/Aldh2的mRNA和蛋白水平具有相反的效应（图6I）。这些数据提示miR-27a-3p调节Acsl1和Aldh2，影响HCC的发展。
图6 miR-27a-3p调节Acsl1和Aldh2的表达并且影响细胞增殖
经HFD喂养后母系血清中miR-27a-3p的水平升高，影响子代HCC的易感性
母系miRNAs影响胎儿的表型。研究者检测了母系血清中9种miRNAs（图5C），在HFD胁迫下发现母系血清中miR-27a-3p水平逐步升高（图7A）。研究者假说母系血清中miR-27a-3p的水平可能影响子代肝脏中miR-27a-3p以及靶基因的水平。为了检测这一可能性，miR-27a-3p agomir注射入成年小鼠，在3h和3天血清中miR-27a-3p水平显著升高，在7天恢复正常水平。当将miR-27a-3p agomir每隔一天注入怀孕C57BL/6小鼠从E12.5到E18.5，结果发现miR-27a-3p显著上调并且Acsl1和Aldh2的mRNA和蛋白水平下调（图7C-D）。
因此研究者假说母系血清中miR-27a-3p水平的改变可能影响子代中HCC的易感性。为了验证这一可能性，研究者将miR-27a-3p agomir注入孕期C57BL/6小鼠，并且在p15进行DEN并且在断奶后进行NC或者HFD（图7B）。重要的是母系注射miR-27a-3p agomir，子代肿瘤的数量显著升高。在HFD条件下子代中发现了肿瘤负荷加重（图7E-F）。H&E和三色染色提示注射miR-27a-3p agomir的母系产生的子代肝脏的病理加重，而在agomir注射母系HFD喂养子代中的变化最显著（图7G）。此外， 母系注射agomir，子代肝脏中miR-27a-3p显著上调并且Acsl1和Aldh2的mRNA和蛋白水平下调（图7H-I）。
图7 母系miR-27a-3p的水平影响miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2的水平并且使子代对HCC易感
HCC患者中无论肝脏是否肥胖，miR-27a-3p与Acsl1和Aldh2负相关
为了探究HCC中miR-27a-3p-Acsl1/ Aldh2轴的临床相关性，研究者获取了54例临床样本（27例肥胖肝脏相关的HCC，27例非肥胖肝脏相关的HCC）。肿瘤内Acsl1和Aldh2的水平较非癌组织显著较低，且在肥胖的肝脏中更低（图8A）。一致的是，在肿瘤内miR-27a-3p的水平显著高于非癌组织，在肥胖肝脏中显著高于非肥胖的肝脏（图8A）。相关性分析进一步证实miR-27a-3p与Acsl1或者Aldh2之间呈现负相关（图8B）。
图8 miR-27a-3p的表达水平与HCC病人无论肥胖与否肝脏中Acsl1和Aldh2负相关
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目前的研究表明，母亲肥胖会影响后代肝癌的发生和发展。具体而言，肥胖或HFD喂养会增加母体血清中miR-27a-3p的水平，这可能会代际影响后代肝脏中miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2轴。母体肥胖会导致后代代谢性疾病，而HCC与代谢性疾病密切相关，研究者的动物研究揭示了母体肥胖与后代癌症发生之间的联系。
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