综述: PLANT CELL PHYSIOL: 植物MicroRNA与赤霉素信号传导的串扰
编译：Nicole，编辑：景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
赤霉素（Gibberellin, GA）是一种不可或缺的植物激素，在调节种子发芽、茎伸长、叶片发育和花发育中起着重要作用。研究表明，GA主要通过克服DELLA蛋白的抑制作用来调节这些生物过程，DELLA蛋白是GA反应的核阻遏物家族。
MicroRNA（miRNA）已被确定为真核生物中基因表达的主要调控因子，通过抑制其靶基因而参与了许多植物发育过程。在过去的几十年对GA生物合成和信号传导的途径以及miRNA的生物发生和调控的途径进行了深入的研究。越来越多的证据表明，miRNA和GA在调节植物发育中是协调一致的，因为miRNA靶向GA途径中的多个成分，而反之亦然，GA也调节miRNA或其靶基因的表达。本篇综述回顾了miRNA和GA之间的关系的最新研究进展，重点阐述两个miRNA：miR156和miR159。
论文ID
原名：The Crosstalk between MicroRNAs and Gibberellin Signaling in Plants
译名：植物MicroRNA与赤霉素信号传导的串扰
期刊：Plant and Cell Physiology
IF：4.062
发表时间：2020年6月
通讯作者：YuSha、王佳伟
通讯作者单位：韩国基础科学研究所、中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所
DOI号：10.1093/pcp/pcaa079
研究进展
1 前言
赤霉素（GAs）最初被鉴定为来自真菌Gibberella fujikuroi的次生代谢产物，是一种四环二萜类植物激素，调节植物生长和发育过程，包括发芽、茎伸长、成花转变和果实成熟。自发现以来，已在植物和真菌中鉴定出超过136种GA。但是，只有一小部分GA（GA1、GA3、GA4和GA7）在植物中具有生物活性。GA的合成本质上需要三步过程，涉及三个亚细胞区室：（1）在质体中香叶基香叶基二磷酸香叶酯转化为戊香烯，（2）在膜系统中香豆素的戊香烯转化为GA12和（3）在细胞质中GA12连续氧化形成活性GA。总而言之，细胞GA稳态受GA生物合成和分解代谢的控制，这既需要“活化酶”又需要“失活酶”。GA 3-氧化酶（GA3oxs）和GA 20-氧化酶（GA20oxs）是负责生物活性GA4的生物合成的“活化酶”。GAs的主要降解途径是由GA 2-氧化酶催化的（GA2oxs）。此外，水稻ELONGATED UPPERMOST INTERNODE基因（OsEUI）编码一种细胞色素P450单加氧酶，可环氧化GA，并有助于GA失活。甲基转移酶GAMT1和GAMT2对GA的甲基化已被确定为拟南芥种子成熟期间GA降解的另一种机制。此外，越来越多的证据表明，GA代谢可以由GA信号途径介导。
从水稻和拟南芥的遗传和生化分析已经很好地阐明了GA信号转导的成分。GA信号集中在GA–GID1–DELLA模块上，该模块在维管植物之间高度保守，而在苔藓植物中却并非如此。GA信号由可溶性受体GA-INSENSITIVE DWARF1（GID1）感知，该受体最初在水稻中被鉴定，在拟南芥中具有三个直系同源物（GID1A、GID1B和GID1C）。在缺乏GA的转录调节子的情况下，DELLA蛋白通过阻碍GA激活的下游基因的表达来抑制GA信号传导。DELLA蛋白均具有由5个保守氨基酸组成的N末端DELLA域（Asp–Glu–Leu–Leu–Ala，DELLA），但不包含规范的DNA结合域，因此被认为通过与其他转录因子相互作用来调节靶基因的表达。已知INDETERMINATE DOMAIN（IDD）家族蛋白与DELLAs相互作用并充当转录支架来激活下游基因SCARECROW-LIKE 3（SCL3）的表达，这表明DELLA蛋白也起着转录激活因子的作用。生物活性GA与GID1的结合会诱导GID1发生构象变化，并促进GID1与DELLA之间的相互作用。GA–GID1–DELLA复合物的形成增强了F-box蛋白SLY1/GID2与DELLA的结合，然后将DELLA靶向E3泛素连接酶SCFSLY1/GID2复合物，导致DELLA通过26S蛋白酶体蛋白水解途径快速降解。GA释放DELLA蛋白的抑制作用，并刺激下游转录网络来调节植物的生长和发育。
MicroRNA（miRNA）是内源的单链非编码RNA，长度为20-24个核苷酸（nt），在植物和动物的基因表达的转录后调节中起着重要作用。植物miRNA的生物发生首先是初级miRNA（pri-miRNA）开始的连续切割和修饰，由RNA聚合酶II转录并作为标准RNA聚合酶II（Pol II）转录本进行50次加帽、剪接和30多聚腺苷酸化（图1）。RNase III家族酶DICER-LIKE1（DCL1）借助辅助蛋白将含有茎环的pri-miRNA加工成短双链体，包括双链RNA结合蛋白Hyponastic Leaves 1（HYL1）和C2H2-锌指蛋白Serrate（SE图1）。pri-miRNA的加工在切割体（D体）或位于细胞核中的小核RNA结合蛋白D3体（SmD3-体）中进行。短RNA双链体由成熟的miRNA（或引导链）及其过客链（也称为miRNA *）组成。DCL1处理后，miRNA/miRNA *双链体的两条链在30个末端被S-腺苷甲硫氨酸依赖性RNA甲基转移酶HUA ENHANCER进行20-O-甲基化。甲基化的miRNA/miRNA *双链体通过哺乳动物的Exportin5（Exp5）的直系同源物HASTY（HST）从细胞核转运到细胞质中（图1）。
通常，只有双链体的一条链（引导链）被选择性地掺入ARGONAUTE蛋白（AGO）中并形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），而过客链则被降解。拟南芥有10种AGO蛋白，其中AGO1是大多数miRNA的主要效应蛋白。最近的一项研究发现，AGO1以CRM1 / EXPORTIN1（EXPO1）/ NES依赖的方式经历核-胞质穿梭。AGO1的核定位对于大多数甲基化的miRNA从核到细胞质的装载和转运是必需的，而miRNA介导的沉默需要AGO1的核-胞质穿梭。因此，RISC主要在细胞核中组装，并以AGO1：miRNA复合物的形式输出到细胞质中（图1）。miRNA通过碱基配对将RISC导向其靶mRNA，通过RNA裂解和翻译抑制实现靶抑制（图1）。在过去的二十年里，miRNA在植物生长和发育的几乎所有方面都发挥了关键作用，例如相变、器官形态发生和逆境响应。miRNA还通过调控植物激素的代谢、分布和感知来充当植物激素途径的关键调节剂。这篇综述总结了目前在miRNA介导的GA信号传导和生物合成调控机制和功能方面的知识，重点综述miR156、miR159和miR396。
2 miR156-SPL和GA-DELLA在成花转变和腋芽形成中的相互作用
miR156是植物中最保守的miRNA之一。Small RNA测序表明，miR156存在于大量双子叶植物和单子叶植物以及蕨类植物、番茄类和苔藓植物中。miR156已被确定为拟南芥和玉米中营养相变和开花时间的主要调节物。该功能很大程度上归因于其独特的表达模式：miR156在幼苗中高水平积累，并随植物发育而降低。随着年龄的增长，miR156的下降成为植物发育和生理的“计时器”，这确保了每个发育事件都在适当的阶段以精确的顺序发生。更重要的是，miR156的这种与年龄相关的下降在其他物种中保守，其中包括Arabis alpina、Cardamine flexuosa、玉米、杨树、水稻、大豆和番茄。miR156靶向一系列编码植物特有的SQUAMOSA启动子结合蛋白样（SPL）基因的转录识别因子。所有的SPL都共享一个保守的SQUAMOSA启动子结合蛋白（SBP）结构域，该结构域与目标序列上的共有序列基序GTAC结合。拟南芥基因组编码16个SPL基因，其中11个被miR156靶向（表1）。功能研究已证实SPL在拟南芥中差异表达并在植物发育中表现出独特的功能。
表1.拟南芥中miR156和miR159的靶基因。
miR156-SPL模块对于拟南芥的繁殖能力至关重要。miR156的过表达会延缓许多物种的开花，包括拟南芥、台湾南芥、弯曲碎米荠、玉米、马铃薯和水稻。因此，miR156随着年龄的增长而下降，使植物能够逐渐获得生殖能力并最终枯萎，特别是在非诱导性短日照条件下。在拟南芥中发现了miR156调节花粉的调节机制。在幼年期，由于miR156高水平，SPL转录因子的积累很低。随着植物的生长，miR156减少，导致SPL转录本增加。SPL通过两种不同的机制促进叶片中的叶过渡和芽尖（图2）。在茎尖中，SPL15通过激活分生组织同一性基因LEAFY（LFY）以及MADS-box基因，如FRUITFULL（FUL）、APETALA1（AP1）和过表达抑制因子CONSTANS1（SOC1）来诱导开花。在叶片中，SPL9激活另一个miRNA miR172的表达。miR172靶向AP2类转录因子家族，包括AP2、TARGET OF EAT1（TOE1）、TOE2、TOE3、SCHLAFMUTZE（SMZ）和SCHNARCHZAPFEN（SNZ）。miR172的靶标通过抑制FLOWERING LOCUS T（FT）以及SOC1和AP1的表达来抑制光周期依赖性的开花途径。miR172的过表达会加速拟南芥中的花期转换，而AP2或TOE1的过度积累会导致后期表型减慢。因此，叶片中SPL9对miR172的激活减轻了miR172靶向的AP2样转录因子对FT的抑制。
在非感应条件下，通过降解DELLA，GA在加速成花转变中也起着关键作用。GA生物合成和信号转导相关基因的突变导致开花缺陷。DELLA结构域缺失17个氨基酸的GA不敏感DELLAs转基因植物（dellaΔ17）在长日和短日条件下均开花晚。研究表明，DELLAs与几种转录因子发生物理相互作用，从而抑制花粉代谢。例如，DELLAs通过隔离FT激活因子，CONSTANS（CO）和PHYTOCHROME相互作用因子4（PIF4）抑制TF转录。DELLAs还与转录因子FLOWERING LOCUS C（FLC）相互作用，促进FLC下游基因SOC1和FT的转录抑制。最近的一项研究表明，DELLAs与另一个转录因子MYC3结合。MYC3被DELLAs稳定并通过拮抗CO的活性来抑制FT表达。除了这些机制外，GA诱导的开花途径还可以通过DELLA和SPL之间的相互作用整合到miR156介导的开花途径中。DELLA蛋白可以与SPL2、SPL9、SPL10、SPL11和SPL15相互作用。研究显示DELLA与SPL的结合破坏了SPL下游基因的转录激活。因此，DELLAs通过抑制茎尖中SPL15激活MADS-box基因（SOC1和FUL）或通过抑制SPL9降低叶片中的FT表达来延缓植物的成花转变（图2）。此外，DELLA蛋白与CHD3染色质重塑因子PICKLE（PKL）相互作用并减弱其结合能力。最近的一项研究发现PKL直接与MIR156A和MIR156C的启动子结合，导致H3K27ac的水平低和H3K27me3的水平高，并抑制了这两个基因的转录（图2 ）。GA促进花粉也需要PKL，pkl突变体中SPL3、SPL5、LFY和FUL的表达降低。因此，DELLA蛋白通过转录抑制（在SPL3和SPL5的情况下）或蛋白-蛋白质相互作用（在SPL9和SPL15的情况下）抑制SPL，从而发挥其抑制花色的功能。
最近研究表明，DELLA–SPL9模块参与了腋芽的形成。SPL9抑制腋芽同一性基因LATERAL SUPPRESSOR（LAS）的转录，而DELLA与SPL9的结合减弱SPL9对LAS的抑制活性，从而促进腋芽的萌发。有趣的是，LAS诱导GA失活酶GA2ox4的表达，从而在腋芽形成部位形成低GA含量的区域。与该调控网络一致，外源GA处理或GA生物合成酶GA20ox2的异位表达降低了腋芽形成的比例，而GA缺失型突变体ga1-3显示出更多的腋芽形成。
图2. miR156和GA在成花转变中的相互作用。靶向miR156的SPL通过促进茎尖中LEAFY和MADS-box基因的表达并激活叶片中的miR172来促进成花转变。miR172靶向AP2样转录因子，通过抑制FLOWERING LOCUS T（FT）的表达来延迟花期。DELLA通过阻止SPL的活化来抑制转变。一方面，DELLA和SPL之间的相互作用抑制叶片中miR172的激活和茎尖中MADS-box基因的激活。另一方面，DELLAs与CHD3染色质重塑因子PKL结合并减弱其对miR156的前体基因MIR156A和MIR156C的转录抑制。GAs通过降解DELLA并释放其对SPL的抑制作用来促进开花。
3 miR159通过调节GAMYB活性参与GA信号传导
miR159是一种21nt的miRNA，在维管植物中高度保守，并在植物生长、形态发生和繁殖中发挥多方面的作用。拟南芥具有3个MIR159基因（MIR159A、MIR159B和MIR159C），每个基因编码一个独特的同工型，彼此之间相差1-2 nt。在拟南芥中，miR159a和miR159b比miR159c丰富得多。遗传证据表明，MIR159A和MIR159B是具有冗余功能的主要家族成员。单个mir159突变体均未显示任何表型异常，而mir159a、mir159b双突变体（mir159ab）则在种子、叶片和花茎中均表现出发育缺陷。mir159abc的三重突变体与mir159ab是无法区分的，这表示了miR159c在拟南芥中功能的次要性。MIR159A和MIR159B的表达模式非常相似，二者均广泛表达，但在花药中不表达。相比之下，MIR159C的表达主要限于花药和茎尖区域。miR159靶向编码R2R3 MYB结构域转录因子（称为GAMYB）的基因家族。像miR159一样，具有高度保守的miR159结合位点的GAMYB直系同源物存在于大多数陆地植物中。最初，GAMYB被鉴定为由GA诱导的大麦糊粉细胞中的转录因子。在拟南芥中，两个GAMYB样基因MYB33和MYB65是miR159的主要靶标（表1）。众所周知，在大麦和水稻中GA通过减轻DELLAs的抑制作用而积极调节GAMYB的表达。此外，GAMYB可以与下游基因的顺式GA反应元件结合，以转导GA信号。
4 GA诱导种子萌发的miR159-GAMYB途径
GA促进单子叶植物和双子叶植物的种子发芽。种子发芽过程中，GA在胚中产生并分泌到糊粉层中，从而增强了水解酶的合成和分泌，这些水解酶负责在胚乳中移动贮藏化合物以支持早期幼苗生长。在种子萌发期间，GA诱导大麦糊粉细胞中GAMYB的表达。HvGAMYB激活多种水解酶的表达，包括低和高pIα-淀粉酶、EII（1-3,1-4-β）-葡聚糖酶、组织蛋白酶B样蛋白酶和EPB半胱氨酸蛋白酶。在水稻中，成熟的miR159存在于整个植物中，但在种子中几乎没有检测到。同样OsGAMYB在水稻籽实糊粉细胞中高度表达。OsGAMYB缺失突变体显示出响应GA处理的α-淀粉酶表达受损。一旦糊粉层完成其消化功能，GA就会促进拟南芥细胞的程序性细胞死亡（PCD），从而促进发芽胚胎的生长。大麦中GAMYB的过表达导致空泡细胞的产生，这与GA处理诱导的空泡水平相似。在拟南芥中，miR159充当分子开关，仅在种子和花药中限制GAMYB的表达。在营养组织中，MYB33和MYB65的转录水平极低。研究表明，MYB33和MYB65，以及另一种GAMYB，MYB101，是GA调节种子中糊粉的PCD的原因，此时miR159的效力减弱了。myb33myb65-myb101的三重突变体显示糊粉糊化作用发生了改变。总之，靶向miR159的GAMYB通过激活水解酶的表达并促进糊粉细胞中的PCD来积极地转导GA信号传导（图3）。
5 GA调节的雄性育性中的miR159-GAMYB途径
GA在调节花器官的发育中也起着重要作用。由于花药发育异常，GA缺乏导致雄性不育。GAMYB在几种植物的花药中高表达，例如大麦、水稻、小麦、拟南芥和黄瓜。GAMYB过表达的转基因大麦是雄性不育的。这种表型主要是由没有开裂的小而浅的花药引起的，类似于用过量的外源GA处理过的植物。有趣的是，雌雄同株的黄瓜中GAMYB的敲除改变了雄性与雌性花粉的比例，并减少了具有雄性花粉的节的数量。miR159与GAMYB在水稻花药中共表达，可精细调节GAMYB的表达。水稻中GAMYB的消耗会损害成绒毡层的绒毡细胞的PCD和花粉发生，从而导致花药和花粉的发育缺陷。同样，OsmiR159的过表达表现出畸形的花朵，并且是雄性不育的。相反，抑制miR159在水稻中会导致与PCD相关的基因上调。微阵列分析显示，OsGAMYB差异性调节糊粉细胞和花药中的下游基因。OsGAMYB激活花药中2个GA上调的基因：细胞色素P450羟化酶CYP703A3和β-酮酰基还原酶（KAR），它们都编码脂质代谢酶。cyp703a3突变体显示乌氏体和外壁的缺陷形成。值得注意的是，GAMYB-CYP703途径是保守的，对于从苔藓（没有GA信号传导）到高等植物的雄性发育至关重要，这表明GA通过植物体内CYP703A3的预先存在的GAMYB依赖的活性来调节花药发育（图3）。在拟南芥中miR159-GAMYB途径也在花药发育和育性中发挥作用。MYB33和MYB65促进绒毡层中的PCD，是雄性孢子发生所必需的。myb33myb65双突变体和miR159高产植物均是雄性不育的。后来发现，miR159在拟南芥花粉中表达，并传递至中央细胞去降解MYB33和MYB65以促进胚乳的核分裂，抑制miR159活性导致生育力下降（图3）。
6 GA介导的果实发育中的miR159-GAMYB途径
最近研究发现miR159-GAMYB途径与GA介导的果实发育有关。在草莓中，在果实发育过程中检测到具有生物活性的GA，在白色阶段有大量的GA4。此外，功能性的GA信号通路在草莓果实的花托中也很活跃。在花托发育的白色阶段，2个Fa-MIR159基因的表达较低，这与FaGAMYB的高积累同时发生。GA在花托发育的绿色阶段诱导FaGAMYB的表达。FaGAMYB是草莓果实发育的关键调节剂，因为FaGAMYB的下调抑制了花托的成熟和颜色形成（图3）。在番茄中，miR159-GAMYB途径对于胚珠发育和坐果至关重要。miR159的过表达会损害胚珠发育，进一步导致早熟的果实萌发和强制性单性结实（图3）。在葡萄中，外源GA可以有效地诱导单性结实。有趣的是，GA在植物发育过程中促进VvMIR159C的表达并抑制VvGAMYB。在GA诱导的葡萄单性结实过程中，miR159-GAMYB可能参与了基因发育的调控，但该机制尚不清楚。
图3. miR159-GAMYB途径在植物发育中的作用。GAMYB被GA激活并被miR159抑制。miR159的功效在种子中减弱。GA在种子发芽过程中被诱导并激活GAMYB以促进糊粉细胞水解酶和PCD的表达。在花药中，miR159的丰度较低。GA通过保守的依赖CYP703A3的GAMYB依赖性激活来调节花药发育，从而导致花药的PCD。花粉和果实发育也需要miR159-GAMYB途径，有助于雄性育性和果实发育。但是涉及这些过程的机制和下游基因的了解较少。
7 参与GA生物合成的miRNA
miR396是一种进化保守的miRNA，靶向生长调节因子（GRF）家族的一组转录因子。GRF在拟南芥中的功能与协调叶和根发育中的细胞分裂和分化有关。水稻基因组编码一个miR396亚型，在miRNA的7-8位插入了鸟嘌呤，后来被发现是一个单子叶植物特异的miR396变异体。OsmiR396-GRF模块参与多种发育过程和特性的调控，例如花形态发生、花发育、颗粒大小和产量、植株形态和类胡萝卜素合成。最近有报道说，OsmiR396d在水稻中的过表达表现出与GA缺陷型突变体相似的表型。在过表达OsmiR396d的稻米中，OsGID2和几种GA生物合成基因的表达降低，例如椰油酰二磷酸合酶（CPS1）、ent-kaurene氧化酶2（KO2）、grain number per panicle（GNP1）/ GA20ox1和GA20ox3等。OsmiR396可能通过其靶标之一OsGRF6调节GA生物合成，因为osgrf6突变体中GA生物合成基因的水平和GA（GA1、GA19和GA53）的内源性含量被下调。有趣的是，通过GA3处理，OsmiR396d的表达增加，而用GA生物合成抑制剂多效唑处理时，OsmiR396d的表达减少。这表明OsmiR396对水稻中GA生物合成的反馈调控。OsmiR156的靶标是Ideal Plant Architecture 1（IPA1），其编码OsSPL14并调节水稻中的植株形态。最近，染色质免疫沉淀和电泳迁移率变化分析表明IPA1直接与GA生物合成基因（包括CPS1、Ent-月桂酸氧化酶（KAO）、KO2、GNP1 / GA20ox1和semidwarf1）的启动子上的GTAC基序结合（SD1）。在CRISPR / Cas9介导的miR156（mir156-abcdfghikl）突变型突变体中，一些GA生物合成基因（CPS1、KAO、KO2、GNP1、SD1和GA20ox4）被显着下调，而GA失活基因（GA2ox6、GA2ox8、GA2ox10和EUI1）增加。mir156abcdfghikl中两种具有生物活性的GAs ：GA3和GA7的水平要比野生型水稻低得多，这表明OsmiR156调节GA的生物合成。但是，在拟南芥中的研究发现，GA合成途径中的大多数基因（GA2ox1、GA3ox1、GA20ox1和GA20ox2）的表达不受miR156影响。在miR156过表达植物中，只有两个GA失活基因GA2ox2和GA2ox6被适度上调，但GA4的含量没有变化。miR156靶向的SPL可能在单子叶植物和双子叶植物中发展出不同的功能。在水稻中，miR156通过抑制IPA1促进GA积累，IPA1直接调节GA生物合成和信号途径中的多个基因。种子中高水平的miR156导致GA含量升高，从而抑制了种子休眠并促进了种子发芽。
展望
GA信号通过GA–GID1–DELLA模块进行转换。由于DELLA蛋白不包含规范的DNA结合结构域，因此它们通过与其他转录因子相互作用来调节下游基因。根据miRbase的注释，拟南芥和水稻中成熟的miRNA的数量分别为384和738。有趣的是，植物中的大多数miRNA靶标都编码对于植物生长和发育必不可少的转录因子。因此，GA信号和miRNA靶基因模块通过DELLA和miRNA靶转录因子之间的直接相互作用而广泛连接并不奇怪。考虑到转录因子通常以组织特异性和时间性表达的事实，针对miRNA的转录因子在GA信号传导中的作用在组织或单细胞水平上的研究是一个悬而未决的问题。系统的蛋白质-蛋白质相互作用测定和体内DELLA-转录因子相互作用的可视化将有助于解决这个问题。miRNA及其靶标在GA生物合成中的作用尚未得到广泛研究。值得注意的是，一些证据表明，保守的miRNA可能在不同物种之间的GA信号传导和生物合成中发挥独特的功能和调控机制。例如，除了在GA信号转导中的保守作用外，miR159-GAMYB还能调节水稻中的GA生物合成。OsmiR159d靶向OsGAMYBL2，该蛋白与GA生物合成中的2个基因CPS1和GA3ox2的启动子结合。同样，SPL与水稻和拟南芥中的DELLA结合。但是，miR156仅正调控水稻的GA生物合成。GAMYB / SPL是否确实会影响水稻体内的GA含量？DELLA对GAMYB和SPL活性的调节与GAMYB和SPL在GA生物合成中的作用如何协调？因此，阐明水稻中GAMYB / SPL与GA生物合成之间的联系的生物学意义是未来的重要研究方向。GA和miRNA都是植物发育的重要调节剂。1960年代的绿色革命通过结合半矮化性状与其他农业技术（肥料、农药和灌溉技术），极大地提高了全世界的谷物产量。半矮稻基因sd1编码有缺陷的GA20ox，而小麦的矮化高度（Rht）则编码突变的GA不敏感的DELLA蛋白。已经证明miRNA及其靶基因均可用于改善农艺性状。有鉴于此，目前对miRNA和GA之间相互作用的知识和进一步的研究将对整合独特的农业重要性状的植物生物技术具有重要价值。
更多推荐
1 综述 | TRENDS PLANT SCI：miRNA作为根际植物与微生物的相互作用关键媒介
END