Nature 深度剖析：管坤良与 Alj 组研究成果为何截然相反，Hippo 通路调控乳腺癌的两面性...
乳腺癌是当今女性中最常见的恶性肿瘤，对女性健康存在重大威胁。雌激素受体（ERα）驱动了相当一部分乳腺癌的进展，对于这部分乳腺癌，靶向 ERα 或雌激素合成的内分泌疗法是重要的治疗手段。然而，相当多的患者仍会出现复发及耐药的现象 [1]。因此，探究 ERα 在乳腺癌中的表达调控机制具有重要科学意义及转化价值。
2017 年一篇发表于 Nature 的报道指出，抑癌通路 Hippo 可以介导 ERα 的降解，进而调控 ER + 乳腺癌对内分泌疗法的敏感性。然而，近日 Hippo 领域大牛管坤良组却对此提出了截然相反的结论 —— Hippo 通路反而促进 ERα 的表达。
到底是什么使得这两篇文章产生了如此大的差异呢？
作为重要的抑癌通路和明星级研究热点，Hippo 通路不仅在器官发育、尺寸控制和组织再生中起重要作用，更与多种癌症的进展密切相关。在 Hippo 通路中，激酶 MST1/2 在辅因子 MOB1 和 SAV1 的帮助下，磷酸化活化激酶 LATS1/2，后者进一步磷酸化转录激活因子 YAP/TAZ，使其滞留在细胞质中并降解。当 Hippo 通路上游信号减弱或丢失时，YAP/TAZ 磷酸化水平降低，发生核转位，结合转录因子 TEAD1-4，调控一系列下游基因的表达。
哺乳动物 Hippo 通路示意图 [2]
Hippo 通路的失调常见于多种肿瘤，YAP/TAZ 的异常活化不仅促进肿瘤发生，更调控上皮 - 间质转化（EMT）、肿瘤干细胞干性维持、对化疗和多种靶向疗法的耐药、免疫逃逸等肿瘤病理过程 [2,3]。业已发现，在 ER + 乳腺癌中，Hippo 通路的失活使 YAP/TAZ 活化并上调 CDK4/6 的表达，从而介导对 CDK4/6 靶向药的耐药性 [4]。
阐明 Hippo 通路对 ERα 的调控机制，对深入了解 ER + 乳腺癌的进展机制及寻找新的潜在治疗靶点具有重要意义。
2017 年，来自瑞士 Friedrich Miescher Institute 的 Mohamed Bentires-Alj 团队于 Nature 发表题为 The Hippo kinases LATS1 and 2 control human breast cell fate via crosstalk with ERα 的文章，报道了 Hippo 通路中的 抑癌激酶 LATS1/2 通过调控 ERα 及 YAP/TAZ 的降解，决定原始乳腺上皮细胞（PHBECs）的分化，及 ER + 乳腺癌细胞对内分泌治疗的敏感性。
图片来源：Nature
作者发现，抑制 LATS1/2 的表达促使 PHBECs 往腔面型（Luminal）方向分化，产生具有强自我更新能力（self-renewal）的腔面谱系细胞。在机制上，LATS1/2 可以通过结合 ERα 并募集泛素连接酶底物受体 DCAF1/DCAF13，通过泛素 - 蛋白酶体途径诱导 ERα 的降解，且这一过程不依赖其激酶活性或 YAP/TAZ 蛋白。
基于此，作者进一步发现，敲降 LATS1/2 增加了 MCF-7 等腔面型乳腺癌细胞中 ERα 的稳定性，使癌细胞耐受内分泌治疗药物氟维司群（Fulvestrant, 可诱导 ERα 降解），但不影响 ERα 拮抗剂他莫昔芬（Tamoxifen）的疗效。
但出乎预料的是，2021 年 3 月 3 日，Hippo 领域大牛，来自美国加州大学圣地亚哥分校的管坤良课题组于 Nature 以 Matters arising 的形式发表题为 Hippo signalling maintains ER expression and ER+ breast cancer growth 的文章，提出了与上文结果截然相反的结论 —— 抑癌激酶 LATS1/2 反而促进 ESR1（ERα 编码基因）的表达，从而驱动 ER + 乳腺癌的发展。
图片来源：Nature
本文作者首先通过 CRISPR 同时敲除了 MCF-7 细胞中的 LATS1/2，然而意外的是，细胞生长竟然停滞了，且 ESR1 mRNA 水平和 ERα 蛋白水平大幅下降。
但 Alj 组文章中，LATS1/2 仅在蛋白水平上降解 ERα，在癌细胞系 T47D 中敲降 LATS1 不影响 ESR1 mRNA 水平（Extended Fig 8b）。
考虑到方法的不同，作者采用了上文作者使用的 shRNA 敲降 LATS1/2，但发现敲降 LATS1/2 既不影响 ERα 水平，也不活化 YAP/TAZ。作者猜测，可能是残余的 LATS1/2 的量仍足以抑制 YAP/TAZ 活化。
此外，在其它 ER + 乳腺癌细胞系，及小鼠的输卵管、乳腺和子宫内膜类器官（organoids）模型中，敲除 LATS1/2 均可抑制 ESR1 的表达。另一方面，在 MCF-7 细胞中过表达 LATS1 或其激酶缺失突变体，对 ERα 的蛋白水平没有影响。
进一步，作者通过构建不同突变体，发现 LATS1/2 对 ESR1 mRNA 水平的维持既依赖于其激酶活性，又需要 YAP/TAZ 蛋白的参与，并且在敲除 LATS1/2 后进一步敲除 YAP/TAZ，可以完全挽救 ESR1 表达，表明 LATS1/2 很有可能是通过抑制 YAP/TAZ 的活化，从而维持 ESR1 基因的表达。但 YAP/TAZ 如何抑制 ESR1 基因转录则尚不明确。
在表型层面上，LATS1/2 双敲除 MCF-7 细胞增殖减弱，在荷瘤小鼠中生长缓慢，对 ERα 抑制剂 4 - 羟基 - 他莫昔芬（4OHT）不敏感，且在其中过表达 ERα，可以挽救其克隆形成能力。这一结果说明，LATS1/2 的缺失降低了 ERα 表达量，从而抑制了 MCF-7 细胞的生长。
LATS1/2 敲除减缓 MCF-7 细胞生长
综上所述，尽管机制不尽相同，但管组的这篇文章与 2017 年这篇 Nature 的大部分结果相悖。那么，原文的作者又作何回应呢？
2021 年 3 月 3 日，Mohamed Bentires-Alj 课题组于 Nature 发表回应，提出了可能导致双方如此迥异的实验结果的原因：
1. 第一个焦点集中于使用 CRISPR 敲除和 shRNA 敲低 LATS1/2 所带来的差异。Bentires-Alj 组发现，shRNA 载体慢病毒高滴度感染细胞会迟滞其生长，但根据原文结果，LATS1/2 表达量应该与 ERα 表达量负相关，降低 LATS1/2 表达量应该会使细胞生长加快。这表明中等程度的降低 LATS1/2 的表达量和大幅降低乃至敲除 LATS1/2，可能会造成不同实验结果。作者猜测，敲除 LATS1/2 带来的 YAP/TAZ 异常持续活化可能对细胞状态有较大的改变，从而使细胞启动某些不为人知的代偿通路以维持稳态，从而改变了 Hippo 通路对 ERα 的调控模式。此外，在 LATS1/2 过表达实验中，Alj 组使用的是瞬间转染，而管组使用的是稳定转染，作者认为这或许会带来一定差异。
2. 其次，双方使用的细胞培养条件有部分不同。Bentires-Alj 组使用的是 M5 培养基培养 PHBECs 和 MCF10A 细胞，鉴于这一培养基可以维持乳腺上皮细胞的增殖和分化，其对 ERα 及相关因子的影响可能与 DMEM 等标准培养基不同。
此外，虽然双方均使用了 MCF-7 细胞系，但由于癌细胞的高度异质性和基因组不稳定性，或许双方实验室的细胞是不同的亚克隆，在生理生化性质上其实有较大差异。
3. 作者认为，双方报道的机制也许都是真实的，可能只是 Hippo 通路对 ERα 在不同条件下的正向和负向调控。并且可能与不同的 Hippo 通路上游信号有关（见本推送图 1）。作者提出，管组文章 Fig 1-o 中，敲除 LATS1/2 彻底消除了 ERα 的表达，但只敲除 YAP/TAZ，ERα 的表达量只是稍微上调，说明 ERα 的表达调控可能存在更复杂的机制。
敲除 LATS1/2 和（或）YAP/TAZ 对 ERα 表达的影响
笔者认为，Alj 组的回应在一定程度上是有道理的，但尚不足以完全解释两篇文章的差异。Alj 组的原文中，在 PHBECs 中敲降 LATS1/2 后，并未产生典型的 YAP/TAZ 靶基因转录谱（Extended Fig 3），且 ESR1 mRNA 水平上调（Fig 4a）。说明 PHBECs 中，YAP/TAZ 的调控机制与乳腺癌细胞中或许不同，可能源于 YAP/TAZ 的不同翻译后修饰或辅因子，从而对 ESR1 的转录产生不同的调控效应。
但是，Alj 组在 MCF-7、T47D 等乳腺癌细胞中的表型实验，和蛋白水平的机制实验（Fig 4b-e, Extended Fig 8, Fig 9），也都得到了支持其结论的结果。当然，这并不能说明 Alj 组的结论一定不可靠，其蛋白机制部分的实验还亟需验证。同时，管组报道的结果也只是表型实验居多，也需要更深入的机制探究。
除上文外，其它文献亦报道了 Hippo 与 ERα 的关系。YAP1/TEAD4 可以作为 ERα 的辅因子，促进 ERα 相关增强子的激活，从而促进 ERα 下游信号通路的激活及 ER + 乳腺癌的进展 [5]。ERα 亦对 Hippo 通路有影响：ER + 乳腺癌中，CRABP2 可以结合 LATS1 并抑制其泛素化降解，从而抑制 YAP/TAZ 的核转位；但 ER - 乳腺癌中，CRABP2 反而促进 LATS1 泛素化降解，促进 YAP/TAZ 的活化，但具体机制尚不明确 [6]。这些研究成果说明，ER + 乳腺癌细胞中 ERα 与 Hippo 间可能存在精密的反馈调控机制，并受到 CRABP2 等辅因子的调节，从而一定程度上造成了上述两文结论的差异。
总而言之，真理是越辩越明的。笔者真心希望，不论最终结果如何，这一争鸣都能加深人类对乳腺癌、雌激素受体与 Hippo 通路的认识，为新的靶向疗法的开发添砖加瓦，最终造福广大患者。
原文链接:
Alj 组原文：https://www.nature.com/articles/nature20829
管坤良组原文：https://www.nature.com/articles/s41586-020-03131-5
Alj 组回应：https://www.nature.com/articles/s41586-020-03132-4
[1] Pepermans RA, Prossnitz ER. ERα-targeted endocrine therapy, resistance and the role of GPER. Steroids. 2019;152:108493. doi:10.1016/j.steroids.2019.108493
[2] Zheng Y, Pan D. The Hippo Signaling Pathway in Development and Disease. Dev Cell. 2019;50(3):264-282. doi:10.1016/j.devcel.2019.06.003
[3] Wu Y, Li M, Lin J, Hu C. Hippo/TEAD4 signaling pathway as a potential target for the treatment of breast cancer. Oncol Lett. 2021;21(4):313. doi:10.3892/ol.2021.12574
[4] Li Z, Razavi P, Li Q, et al. Loss of the FAT1 Tumor Suppressor Promotes Resistance to CDK4/6 Inhibitors via the Hippo Pathway. Cancer Cell. 2018;34(6):893-905.e8. doi:10.1016/j.ccell.2018.11.006
[5] Zhu C, Li L, Zhang Z, et al. A Non-canonical Role of YAP/TEAD Is Required for Activation of Estrogen-Regulated Enhancers in Breast Cancer. Mol Cell. 2019;75(4):791-806.e8. doi:10.1016/j.molcel.2019.06.010
[6] Feng X, Zhang M, Wang B, et al. CRABP2 regulates invasion and metastasis of breast cancer through hippo pathway dependent on ER status. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):361. Published 2019 Aug 16. doi:10.1186/s13046-019-1345-2