MiSeq系统（系列7—标准文库变性及稀释)

本指南介绍了对Illumina®MiSeq® system上进行测序的文库进行变性和稀释方法，同时介绍了用作测序控制PhiX文库的制备说明。

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1、耗材和设备

名称	供应商
HT1(Hybridization Buffer), thawed and prechilled	Illumina提供的MiSeq Reagent Kit
IlluminaPhiX Control, Catalog # FC-110-3001	Illumina(选择)
1.0N NaOH, molecular biology-grade	一般实验室供应商
Tris-Cl10 mM, pH 8.5 with 0.1% Tween 20	一般实验室供应商
1.5ml的离心管	SciGene,catalog # 1057-34-0, or equivalent

2、试剂准备

2.1准备新鲜稀释的NaOH

1. 取800µLaboratory-grade water至1.5ml微量离心管中。

2. 添加200µL的1.0NNaOH，获得1ml含0.2NNaOH溶液。

3. 漩涡混匀离心备用。

注：

为防止小的移液误差影响最终的NaOH浓度，准备至少1ml新鲜稀释的NaOH。始终准备新鲜稀释的NaOH用于变性文库以便簇生成，新鲜配置的氢氧化钠必须在12小时以内使用.

2.2准备HT1

1. 将-25°C ~ -15°C储存的HT1移至室温溶解。

2. 待HT1溶解后储存至2°C ~ 8°C冰箱中备用。

2.3稀释变性PhiX质控

根据测序试剂版本稀释PhiX质控

名称	最终PhiX浓度
MiSeq Reagent Kit v3	将变性PhiX对照稀释至20 pM，对于v3试剂能够产生最佳簇密度
MiSeq Reagent Kit v2	将变性PhiX对照稀释至12.5pM，对于v2试剂能够产生最佳簇密度

2.3.1稀释PhiX质控至4nM

1. 取2µl10nM PhiX文库至1.5ml的微量离心管中。

2. 添加3µl 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 with 0.1% Tween 20。

2.3.2变性4nM PhiX质控

1. 向上述准备好的4nM PhiX文库中加入5µl已准备好的0.2NNaOH。

2. 短暂漩涡混匀后280× g离心1min。

3. 室温孵育5min。

4. 添加990µl准备好的HT1，获得1ml含20pM变性的PhiX文库。

注：

您可以将变性的20pM PhiX文库在-15℃至-25℃下保存3周。3周后，簇密度趋于减少。

2.3.3稀释PhiX文库至12.5pM（如果您正在使用MiSeq试剂盒v3，则不需要进一步稀释）

1. 取上述已变性的20pM PhiX文库375ul至1.5ml的离心管中。

2. 添加225µl预冷的HT1，至终体积600 µl 的12.5 pM PhiX文库。

2.4稀释变性文库

标准归一化法

推荐使用文库制备文件中的标准文库量化和质量控制程序进行归一化，上样浓度取决于用于测序运行的试剂版本，实际实验中，上样浓度可能随文库的制备及定量方案而变化。

名称	兼容的变性和稀释步骤
MiSeq Reagent Kit v3	4 nM library—Results in a 6–20 pM loading concentration.
MiSeq Reagent Kit v2	4 nM library—Results in a 6–20 pM loading concentration. 2 nM library—Results in a 6–10 pM loading concentration.

注：

确保在用HT1稀释后，最终溶液中NaOH的浓度不超过0.001（1mM），因为文库中NaOH的浓度抑制文库与流动槽杂交并降低簇密度。

2.4.1变性4 nM的文库

1. 取5µl待变性的4nM文库至1.5ml的微量离心管中。

2. 添加5µl已准备好的0.2NNaOH。

3. 短暂漩涡混匀后280 × g离心1min。

4. 室温孵育5min。

5. 添加990 µl准备好的HT1，获得1ml含20pM的变性文库。

6. 根据上机需求将20 pM的变性文库稀释至所需上机浓度，上样体积600μl。

浓度	6pM	8pM	10pM	12pM	15pM	20pM
20pM文库	180µl	240µl	300µl	360µl	450µl	600µl
预冷HT1	420µl	360µl	300µ	240µl	150µl	0µl

2.4.2变性2nM的文库

1. 取5µl待变性的2nM文库至1.5ml的微量离心管中

2. 添加5µl已准备好的0.2N NaOH

3. 短暂漩涡混匀后280 × g离心1min

4. 室温孵育5min

5. 添加990 µl准备好的HT1，获得1ml含10pM的变性文库

6. 根据上机需求将10 pM的变性文库稀释至所需上机浓度，上样体积600μl。

浓度	6pM	8pM	10pM
10pM文库	360µl	480µl	600µl
预冷HT1	240µl	120µl	0µl

3.文库与PhiX质控文库混合

对于大多数文库，加入1％的低浓度PhiX对照作为测序质控。对于碱基组成多样性差的文库则至少加入5％的PhiX作为测序质控，实际PhiX百分比取决于文库的质量和浓度。

名称	大多数文库1％‍	碱基组成多样性差的文库5％
变性和稀释的PhiX文库	6µl	30µl
变性和稀释的文库	594µl	570µl

将配置好上机文库放置至冰上，直到您将其加载到测序试剂盒中。

碱基组成多样性差的文库（Low diversitylibraries）是大量读数具有相同序列的文库。一些研究表明转录物、低复杂性扩增子库、接头二聚体或亚硫酸氢盐测序中存在大于25%低序列多样性。PhiX的高浓度加入有助于平衡序列多样性的整体缺失。