细胞治疗：植入细胞产外泌体药物递送的帕金森病的疗法
外泌体是细胞衍生的纳米囊泡(50-150 nm)，介导细胞间通讯，是候选治疗药物。然而，外泌体信息传递（如mRNA）效率低，以及缺乏设计外泌体的方法阻碍了它们治疗干预的发展。在这里，本文报道了一套外泌体转移到细胞(EXOtic)设备，能够在设计的哺乳动物细胞中高效定制生产设计外泌体。这些在外泌体生产细胞中的遗传编码设备可以增强外泌体的产生、特异性mRNA包装以及将mRNA递送到靶细胞的细胞质中，从而实现高效的细胞间通讯，而不需要浓缩外泌体。此外，植入活老鼠体内的工程化生产细胞可以持续地向大脑传递mRNA。在体内和体外模型中，设计的外泌体通过治疗性过氧化氢酶mRNA的递送可减轻帕金森病的神经毒性和神经炎症，这表明EXOtic装置具有用于RNA递送的治疗应用的潜在用途。
外泌体目前被认为是细胞间通讯的特殊分泌囊泡，并被认为参与了各种生物过程。然而，外泌体信息(如外泌体中包含的mRNA、miRNA和蛋白质)的转移效率很低，这阻碍了它们确切作用的阐明。另一方面，基于它们的生物相容性、生物利用度和跨越血脑屏障的能力，它们被认为具有作为RNA药物载体的潜力。考虑到以工程化哺乳动物细胞为基础的治疗药物的最新发展，这些药物可以植入患者体内并根据需要分泌治疗蛋白。我们预测，能够植入患者体内的哺乳动物细胞和原位分泌含有生物制药编码mRNA的治疗性外泌体也具有潜在治疗用途。但是目前仍缺乏设计外泌体的能力，而且由于生产和信息传递效率低，目前使用外泌体作为治疗药物的策略仍需要外泌体的体外浓缩和RNA电穿孔。为了克服这些挑战，需要一种新的设计策略来创造能显著提高和可控外泌体通信效率的设计外泌体。为此，本文重点研究了以下过程:(1)外泌体生物发生，(2)将特定RNA包装到外泌体中，(3)分泌外泌体，(4)靶向，(5)将mRNA递送到靶细胞的细胞质中。
把外泌体转移到细胞(EXOsomal Transfer Into Cells, EXOtic)设备是一种控制装置，它可以增强这些步骤，无需浓缩外泌体就能高效传递外泌体mRNA。我们在体内证实了工程外泌体产生细胞的功能。此外，我们通过开发一种外来疗法，在帕金森病的体外和体内模型中减轻神经毒性和神经炎症，证明了由外来设备工程的细胞产生的设计外泌体的潜在治疗价值。
外泌体生产促进剂的研制。
为了通过增加外泌体的生物合成和分泌来促进外泌体的产生，研究者首先在HEK-293T细胞中进行筛选，以发现能够促进外泌体产生的基因。具体是将一种小而有效的生物发光报告基因nanoluc (nluc)融合到CD63的C端来制备了一个报告基因，这是最广泛使用的外泌体标记之一。将该报告基因与编码增强外泌体产生候选基因的质粒共转染，逐步离心去除掩蔽信号后检测细胞培养上清中的发光情况(图1a, b)。研究者鉴定STEAP3(参与外泌体生物合成)、syndecan-4 (SDC4;支持内质体膜形成多泡体的出芽)和L -天冬氨酸氧化酶片段(NadB;可能通过调节柠檬酸循环来促进细胞代谢)作为潜在的合成外泌体生产促进剂。这些基因的组合表达显著增加了外泌体的产生，确保转染细胞以固定比例接受所有增强基因的的三顺反子质粒载体（pDB60，以下简称外泌体生产增强剂)，使上清液中的发光信号增加了15- 40倍(视细胞条件而定)(图1b)。大多数发光信号来自于囊泡相关的CD63-nluc，而不是可溶性nluc。研究者还通过使用另一种报告细胞CD9-nluc证实了加强因子的作用，表明加强因子对不同外泌体亚群的有效性。此外，通过直接定量外泌体蛋白CD9和TSG101证实了外泌体的生产的促进作用。最重要的是，纳米颗粒追踪分析(NTA)显示，在不改变其大小分布的情况下，外泌体的产量显著增加了一倍(图1c)。总之，这种方法有效地增加了外泌体的产生。
图1
外泌体mRNA与外来装置的传递。
接下来，研究者开发了一种将特定RNAs包装到外泌体（RNA包装装置)和一种帮助RNA递送到靶细胞胞质内的装置(胞质输送辅助物)(图2a)。对于RNA包装装置，研究者将与C/DboxRNA结构结合的古细菌核糖体蛋白L7Ae与CD63的C端缀合，并将一个C/Dbox插入到报告基因的3 '非翻译区(3 ' -UTR)，通过L7Ae与3 ' -UTR的C/Dbox的相互作用，编码报道蛋白nluc的转录物可以而很好地整合进外泌体(图2a)。作为一种潜在的细胞质传递辅助物，研究者重点研究了一种间隙连接蛋白 (Cx43)，最近报道它在外泌体中富集，并通过形成六聚体通道增强从外泌体到靶细胞的信息传递，并存在持续活性的突变体S368A。将潜在的RNA包装装置和胞质传递辅助物，外泌体产生促进剂、编码nluc mRNA在其3'UTR中带C/Dbox(es)的报告基因，以及靶向模块RVG-Lamp2b一起共转染。据报道，RVG-Lamp2b可通过与烟碱乙酰胆碱受体(CHRNA7) 结合，将外泌体靶向到大脑。将含有设计外泌体的上清液（无需进一步浓缩外泌体）用于表达CHRNA7的HEK-293T细胞，然后将nluc mRNA翻译到靶细胞后进行发光检测。结果显示，只有当所有成分都存在时，靶细胞才会发出强烈的发光，表明每个设备的功能。从产生外泌体的细胞培养上清中去除外泌体，可显著降低发光率，表明信号确实是通过外泌体的转移产生的。C/Dbox重复次数显著影响传递效率 (特别是在没有C/Dbox时几乎没有检测到发光)。而且具有持续活性的Cx43 S368A突变体是比野生型Cx43更有效的细胞质传递辅助物。因此，已经确定并开发了高效外泌体细胞间通信所需的组件，并将它们命名为EXOtic装置。
图2
传递外泌体过氧化氢酶mRNA可缓解神经毒性。
接下来，研究者评估了设计的外泌体将治疗相关mRNA传递到靶细胞的能力。帕金森病是一种中枢神经系统的退行性疾病。神经元细胞死亡是帕金森氏病的一个重要原因，过氧化氢酶的传递可以通过保护神经元免受氧化损伤来减轻细胞死亡。由于外泌体可以穿过血脑屏障，研究者评估了配有EXOtic装置的外泌体产生的过氧化氢酶mRNA是否可以缓解6-羟多巴胺(6-OHDA)引起的神经元细胞死亡。6-OHDA被广泛用于引发实验性帕金森病，因为它通过产生活性氧(ROS)在一定程度上损害了神经元。事实上，由工程化外泌体产生细胞产生的设计外泌体显著降低了6-OHDA对CHRNA7阳性Neuro2A细胞的神经毒性，且不需要外泌体浓度，直接表明我们的设计外泌体可传递具有生物学功能的mRNA，具有治疗潜力。通过在神经元和小胶质细胞共培养中加入LPS的第二种神经毒性模型，研究者证实了含有过氧化氢酶mRNA的设计外泌体可缓解神经毒性。
图3
外泌体mRNA在小鼠的脑内传递。
此外，研究者通过将工程化外泌体产生细胞(RVG-Lamp2b将外泌体靶向到大脑)植入活小鼠，评估了其在体内的潜力(图3c)。首先，在皮下植入产生CD63 - nlucc标记的外泌体的细胞，并证实在治疗动物的血流中存在设计的外泌体。其次，设计的携带nluc mRNA的外泌体可以将功能性mRNA传递到脑组织中，诱导mRNA编码的nluc蛋白在靶细胞中表达(图3d)。事实上，在有装置的条件下，从大脑中观察到更高的nluc活性，这表明EXOtic装置在体内是功能性的，nluc的传递确实是由外泌体mRNA转移介导的。为了证实成功的治疗是基于外泌体转移到大脑，而不是设计细胞从基质凝胶中逃逸，我们将外泌体产生细胞胶囊化在一个装置中，保留了外泌体产生细胞，但仍然可渗透到外泌体。正如预期的那样，总体传递效率相似，证实了这种效果是由于将设计的外泌体转移到大脑。
使用过氧化氢酶mRNA治疗帕金森病的外来疗法。
接下来，研究者从植入活小鼠体内的工程外泌体产生细胞中，将治疗性mRNA传递到大脑中。神经炎症是帕金森病的一个重要原因。由于过氧化氢酶可减轻由6-OHDA等神经毒性试剂引起的神经炎症，研究者评估了由外泌体产生细胞分泌的外泌体传递的过氧化氢酶mRNA是否可减轻活小鼠体内的神经炎症。在小鼠脑内注射6-OHDA后，通过分析与脑内神经炎症相关的几种标志物(GFAP, Iba1, TNFα， CD11b)的表达水平，证实了含有过氧化氢酶的设计外泌体对ROS引起的神经炎症的减弱(图3e)。植入缺乏EXOtic装置或过氧化氢酶mRNA表达盒的细胞后，未观察到神经炎症的衰减，这表明神经炎症的衰减确实是由含有过氧化氢酶mRNA的设计外泌体介导的。
由于系统性炎症是帕金森病的已知危险因素，会引起神经炎症，我们也证实了治疗设计的外泌体缓解了由注射LPS引起的神经炎症(图3g)。总之，这些结果证实，由植入外周的工程细胞产生的包含货物的设计外泌体可以将治疗货物运送到大脑，以治疗实验性帕金森病。
讨论
受合成生物学的启发，我们成功地开发了可高效定制生产设计性外泌体的EXOtic设备，。此外，并展示了外泌体产生细胞通过将过氧化氢酶mRNA传递到大脑治疗帕金森病的潜在应用。
首先，研究者开发了一种外泌体生产增强剂，可以在外泌体生产细胞中进行基因编码。然后开发了一个特定的mRNA包装装置和细胞质传递辅助物。这些设备的联合使用显著增加了外泌体mRNA传递进靶细胞。删除任何组分均可显著降低发光强度，说明所有组分都是有效转移所必需的。C/Dbox repeats的数量影响了通讯效率，这表明mRNA和RNA结合蛋白的关联(RNA包装)和解离(靶细胞功能)的平衡是重要的。事实上，如果没有C/Dbox的3 ' -UTR，就无法检测到强发光，这也表明nluc的传递确实是由mRNA转移到外泌体，然后是靶细胞的胞质溶胶介导的。与野生型Cx43相比，持续活性的Cx43 S368A突变体是一种更有效的细胞质传递助手。在患者来源的人骨髓间质干细胞(hMSCs)中全套EXOtic设备会发挥作用，因为hMSCs被用作治疗外泌体。因此，外来的设备可能成为有效生产设计外泌体的重要工具。
通过证明过氧化氢酶mRNA传递可以在帕金森病的体外和体内模型中减轻神经毒性和神经炎症。尽管一些研究人员已经证明，将过氧化氢酶输送到大脑足以减轻神经炎症，但要达到这一效果，还需要在体外反复给药装载过氧化氢酶的浓缩外泌体。该研究中开发的可植入外泌体产生细胞首次实现了含过氧化氢酶mRNA的外泌体的原位高效生产和传递，这可能会为实现治疗效果的新方法打开大门。与糖尿病等代谢紊乱的治疗不同，帕金森病的成功治疗需要持续高剂量的药物，以减轻任何相关的神经炎症。因此，我们对植入的设计细胞进行了工程设计，以最大限度地原位生产含药物的设计外泌体。
总之，本研究中开发的EXOtic装置可能成为高效生产设计外泌体的重要工具。利用EXOtic装置设计的可植入外泌体开创了一种新的基于外泌体传递治疗性mRNA的治疗途径。
原文链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5880805/pdf/41467_2018_Article_3733.pdf