杨建新点评 | PD-1：功名在手，仍有余香
PD-1（CD279）是活化T细胞中的一种抑制性受体，通过与配体PD-L1和PD-L2结合维持外周免疫耐受，同时也发挥了损伤抗肿瘤免疫的作用。靶向PD-1或其配体的阻断性抗体已经彻底改变了癌症免疫治疗，但目前只有一小部分患者能产生持久的抗肿瘤响应，大多数患者仅出现短暂的响应或完全无响应。这几年，围绕PD-1通路的临床开发似乎进入了瓶颈期，各种联合治疗并没有取得实质性的突破。因此，最近，科学家们又开始对PD-1通路传递抑制性信号的机制进行深入研究，希望借此找到能够改善治疗的关键靶点。
9月18日，最新发表在Science Advances杂志上的一篇为“Revisiting the PD-1 pathway”的综述中，来自哈佛医学院的4位科学家概述了PD-1通路机制方面的最新进展，并讨论了这些新发现的意义和有待填补的空白。
一、PD-1及其配体的表达
PD-1及其配体在先天免疫和适应性免疫系统中的多种细胞中表达，其表达模式已被广泛研究。最初，科学家们主要聚焦诱导PD-1及其配体表达的转录机制，但最近的研究发现，PD-1和PD-L1的表达也受翻译后修饰的调控(图1)。基于CRISPR的筛选揭示，岩藻糖基转移酶Fut8可调控PD-1在细胞表面的表达(图1A)，接受岩藻糖基化（fucosylation）抑制剂处理过的T细胞在体内表现出了更强的抗肿瘤效应。不过，岩藻糖基化影响PD-1的结构和功能的精确生化机制仍有待阐明。PD-1的表达也可能受到E3连接酶FBXO38的调控，该酶介导PD-1K233位点上K48-连接多聚泛素化（K48-linked polyubiquitination）和随后的蛋白酶体降解(图1B)。
PD-L1的表达和稳定性也可在翻译后水平通过糖基化和泛素化调控。只有非糖基化的PD-L1被发现可与GSK3β相互作用，导致PD-L1磷酸化依赖性的蛋白酶体降解(图1C)。相反，通过直接去泛素化或抑制泛素化和PD-L1的降解，CSN5（COP9 signalosome 5）是TNF-α介导的PD-L1稳定所需的(图1D)。
二、PD-1与其配体的相互作用
如图2A所示，根据经典的PD-1/PD-L1相互作用，表达在抗原递呈细胞（APCs）或肿瘤细胞上的PD-L1与表达在T细胞上的PD-1反式结合，减弱由TCR/MHC和CD28/B7-1相互作用介导的T细胞激活。PD-1或PD-L1阻断性抗体可通过阻止PD-1/PD-L1的反式相互作用来减轻T细胞抑制。
如图2B所示，当PD-1和PD-L1在APCs或肿瘤细胞上共表达时，PD-1与PD-L1顺式结合，降低PD-L1与表达在T细胞上的PD-1反式结合的能力。
如图2C所示，PD-L1/B7-1在APCs或肿瘤细胞上的顺式相互作用也会扰乱PD-1/PD-L1的反式结合，导致PD-1介导的T细胞抑制作用减弱。此外，PD-L1/B7-1的顺式结合并没有破坏B7-1与CD28的结合，B7-1/CD28相互作用带来的共刺激效应依然存在。相反，PD-L1/B7-1的顺式结合扰乱了B7-1/CTLA-4轴。
如图2D所示，添加阻断性抗PD-L1抗体来阻断PD-1/PD-L1相互作用也会阻断PD-L1/B7-1相互作用，使释放的B7-1与CTLA-4结合并传递抑制信号。在这种情况下，阻断性抗CTLA-4抗体可能会通过阻止CTLA-4介导的T细胞抑制带来益处。
如图2E所示，PD-L1/B7-1在APCs上的顺式相互作用可阻止调节性T细胞(Treg) CTLA-4介导的B7-1的反式内吞，这种作用会导致APC表面B7-1缺失。
如图2F所示，抗PD-L1抗体可通过干扰PD-L1/B7-1相互作用，使B7-1与Tregs上的CTLA-4结合，促进CTLA-4介导的B7-1反式内吞作用，削弱B7-1介导的共刺激，从而对免疫疗法产生负面影响。
三、PD-1信号传导的机制和靶点
1、PD-1/SHP-2相互作用
PD-1及其配体是B7/CD28/CTLA-4受体家族的成员，该家族成员是I型跨膜糖蛋白，共享由1个“IgV胞外域”、1个“跨膜域”和1个“胞质尾区”组成的基础结构模型。虽然PD-1的胞外结构和相互作用得到了广泛的研究，但有关其胞内结构和信号转导机制的信息却非常少。PD-1的胞质尾区包含两个基于酪氨酸的结构基序：ITIM（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）和ITSM（immunoreceptor tyrosine-based switchmotif）。突变研究表明，PD-1抑制性功能依赖于ITSM磷酸化酪氨酸，这会优先招募磷酸酶SHP-2（Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2）。虽然人们普遍接受SHP-2是PD-1抑制性功能的关键介质，但PD-1的参与导致SHP-2酶活化的确切机制仍不清楚。图3总结了PD-1与SHP-2的相互作用，如图A所示，根据两步结合模型，SHP-2 C-SH2可与PD-1 pY-ITSM以很强的亲和力结合，招募PD-1到SHP-2，而PD-1pY-ITIM与N-SH2结合，从PTP位点置换N-SH2, 以激活磷酸酶。如图B所示，根据二聚模型，SHP-2通过其N-SH2和C-SH2结构域与两个PD-1分子上的两个pY-ITSM残基结合，从而形成了PD-1:PD-1二聚体，并诱导SHP-2的激活。
2、PD-1靶向的信号通路
多项研究已经调查了PD-1对由TCR和共刺激受体激活的关键信号通路的影响，以确定PD-1如何抑制激活的T细胞的扩增和分化，以及如何抑制细胞因子的产生。关于哪条信号通路是PD-1的主要靶点一直存在争论，大多数研究支持PD-1主要靶向TCR和TCR下游信号级联，但也有研究表明，共刺激受体CD28才是PD-1的主要靶点，还有其它研究表明，TCR和CD28平等地被PD-1靶向。不过，虽然这一问题有争议，但很多科学家达成的一个共识是，SHP-2是唯一目前鉴定出的在正常T细胞中负责调节PD-1抑制性信号的直接伙伴。不过，之后又有研究发现，当SHP-2缺失时，SHP-1磷酸酶可以替代SHP-2并补偿PD-1的抑制性功能。
此外，值得一提的是，虽然PD-1介导的信号传导和功能效应主要作用于T细胞，但也有研究提出，PD-1:PD-L1通路可能也在癌细胞中传递了信号。有研究发现，癌细胞可能利用PD-1:PD-L1通路触发相邻肿瘤细胞中的mTOR信号来支持它们的生长。
四、PD-L1信号传导的机制和结果
PD-L1在癌细胞中的表达最初被认为是癌症介导T细胞免疫抑制和耗竭的主要机制。随后，越来越多的研究显示，PD-L1在肿瘤微环境中抗原呈递髓系细胞中的表达对于介导肿瘤特异性T细胞的免疫抑制特性具有同等重要的作用。表达PD-L1的树突状细胞和巨噬细胞可能在介导T细胞免疫抑制中起主导作用，PD-L1在肿瘤微环境中这两种抗原呈递髓系细胞中的表达可以预测PD-L1/PD-1阻断的疗效和治疗结果。PD-L1也可在活化的T细胞中表达，但是其向T细胞传递信号的能力仍受争议。
PD-L1介导的信号传导首先在癌细胞中被研究。PD-L1被认为是一种免疫屏障，在与表达于T细胞上的PD-1连接后在癌细胞中传递抗凋亡信号，从而诱导对T细胞介导杀伤的耐受，保护癌细胞。后续研究表明，PD-L1还能够以不依赖PD -1的方式激活癌细胞内在信号，并通过抑制自噬和激活mTOR增强癌细胞增殖和存活。
PD-L1胞质尾区未被鉴定出明显的与信号传导相关的序列，表明PD-L1使用了非常规的信号传导基序。最近，研究者们在PD-L1的胞质尾区发现了三个保守序列，分别为“RMLDVEKC”、“DTSSK”和“QFEET”基序。值得注意的是，RMLDVEKC和DTSSK基序中的赖氨酸271和280被认为是泛素化的靶点，导致PD-L1的不稳定和下调。PD-L1也可能通过依赖STAT3/caspase-7的途径向肿瘤细胞传递抑制性信号，从而减弱IFN介导的细胞毒性作用。而保守的RMLDVEKC基序是减弱IFN毒性所需的，DTSSK基序则发挥着PD-L1功能负调节因子的作用。抑制PD-L1表达或用PD-1抗体处理有望使癌细胞对IFN细胞毒性变得敏感（图4）。
五、PD-1通过调节代谢重编程来决定T细胞的分化和功能
在T细胞中，代谢不仅支持生长和增殖，而且在驱动分化中起关键作用。氧化磷酸化是naïve T细胞的主要能量来源，但在激活后，naïve T细胞会经历代谢重编程，以进行有氧糖酵解（也被称为Warburg效应），同时增加谷氨酰胺摄取和分解代谢，以维持效应T细胞的健康和驱动记忆T细胞的分化。PD-1信号传导会改变代谢重编程，有助于β-氧化中脂肪酸的利用，从而损害糖酵解、谷氨酰胺分解和支链氨基酸的代谢。而糖酵解的药理学抑制会阻断TH17细胞的分化，促进Tregs的发育。因此，氧化通路可能是一种代谢检查点，有望用于增强PD-1疗法的疗效。
六、PD-1通路在先天免疫细胞中的信号传导及功能
在癌症驱动的紧急骨髓生成过程中，PD-1在普通髓系祖细胞（CMP）中上调，但主要在粒细胞/单核细胞祖细胞（GMPs）中上调，并抑制由驱动紧急骨髓生成的生长因子介导的信号转导和代谢重编程，导致未成熟髓系细胞和免疫抑制MDSCs的积累，以及效应髓系细胞的全身输出减少（图5A）。在髓系细胞中删除PD-1可促进驱动紧急骨髓生成的生长因子介导的信号转导和代谢重编程，导致具有改善的抗原递呈功能的效应髓系细胞的输出，驱动效应记忆T细胞响应和抗肿瘤保护（图5B）。
七、小结
表1 靶向PD-1通路的潜在新免疫治疗策略
PD-1通路是癌症和慢性感染免疫治疗一个有前景的靶点。目前被广泛使用的策略是利用阻断性抗体来靶向这一通路中的成员，以增强对抗肿瘤或慢性感染的T细胞反应。然而，最近发现的调控PD-1和PD-L1表达和功能的新机制显示，还可能通过新的途径来调控这一通路以治疗疾病（表1）。这些令人期待的新疗法均有望与现有的PD-1/PD-L1抗体联合，提高治疗的成功率。
专 家 点 评
基石药业 首席医学官 杨建新博士
近日，Science Advances期刊发表了关于PD-1通路的综述性文章《Revisiting the PD-1 pathway》。
我们知道，程序性死亡受体-1(PD-1)是1992年由京都大学的T. Honjo及其同事发现的凋亡相关基因，PD-1表达是通过T淋巴细胞和B淋巴细胞抗原受体的信号传导诱导，并参与抑制免疫应答。PD-1配体PD-L1（CD274；也称为B7-H1）和PD-L2（CD273；也称为B7-DC）在肿瘤微环境(TME)的癌细胞和抗原呈递细胞(APC)中表达，加上PD-1作为PD-L1的T细胞抑制性受体，导致PD-1及其配体靶向诱导抗肿瘤T细胞应答。这种阻断性抗体的开发和使用带来了癌症免疫治疗的革命。
根据经典的PD-1/PD-L1通路，当PD-1和PD-L1分别在T细胞和APC（或癌细胞）上表达时，PD-1和PD-L1之间的反式结合（binding in trans）触发抑制性信号减弱T细胞应答，这些抑制性信号可被抗PD-1及PD-L1的抗体阻断。然而，最近的一项研究表明，当这些细胞同时表达PD-1和PD-L1时，PD-1/PD-L1相互作用也可以顺式(binding in cis)发生在某些癌细胞和肿瘤浸润APC上。通过脂质双层系统的体外重建和细胞培养检测，研究者证实了当PD-1和PD-L1共表达于相同的APC或癌细胞上，并在相同的细胞表面发生顺式相互作用，导致PD-L1反式结合T细胞上PD-1的能力下降。这种顺式相互作用阻止了经典的PD-1/PD-L1抑制信号，这可能解释了为什么在某些情况下，PD-1阻断不能增强T细胞应答，因为PD-1抗体与肿瘤表达的PD-1结合可能释放PD-L1，并使其能够与T细胞表达的PD-1相互作用，抑制T细胞信号和细胞毒性。对PD-1和PD-L1相互作用的新认知提示阻断PD-1与阻断PD-L1的作用机制可能不完全相同，同时也对肿瘤免疫治疗提供了新的思路，也许同时阻断PD-1和PD-L1通路可以克服这些问题。
今年ESMO会议上公布了PD-1抗体（Tislelizumab）联合PD-L1抗体（BGB-A333）的早期临床结果。在12例晚期尿路上皮癌患者中，整体ORR达到42%，特别是PD-L1高表达组有2例完全缓解，肿瘤控制率高达100%。相比既往研究结果，这一组合疗法不禁让人们对PD-1+PD-L1这一组合产生了浓厚的兴趣。同时在研的还有PD-1/PD-L1双抗，临床前结果展示了PD-1/PD-L1双抗相较单药及联合治疗显示出更强的协同性。
除了与PD-1相互作用，PD-L1还与B7-1(CD80)相互作用。近期研究表明，PD-L1/B7-1相互作用主要是发生在同一细胞上表达的PD-L1和B7-1分子之间的顺式相互作用，但在两个单独细胞上表达的PD-L1和B7-1之间没有反式相互作用。另一项研究检测了PD-L1/B7-1顺式相互作用的功能影响，并确定在APC上PD-L1/B7-1的顺式相互作用破坏PD-1/PD-L1反式结合。通过该机制，表达大量B7-1的APC通过PD-1介导T细胞抑制减弱，恢复T细胞的杀伤功能。另一项研究报道，APC上的PD-L1/B7-1顺式相互作用破坏了PD-1/PD-L1的反式结合，但PD-L1/B7-1顺式相互作用不会破坏B7-1与CD28的结合，并且保留了B7-1/CD28相互作用的共刺激作用。所以阻断PD-1和阻断PD-L1的作用机制存在差异。
基石药业的抗PD-L1舒格利单抗是全球首个基于转基因大鼠的完全人源单克隆抗体平台（OmniRatTM）构建产生的、同时也是国内首个全长全人源的高亲和性重组抗PD-L1单克隆抗体，除了能有效阻断PD-L1与PD-1蛋白的结合，还可以阻断树突细胞上PD-L1/B7-1的相互作用，释放B7-1并通过B7-1与CD28的结合增强树突细胞功能和T细胞激活。
与PD-L1/B7-1顺式相互作用不会破坏B7-1与CD28的结合相反，两者的顺式相互作用会阻止B7-1与CTLA-4结合，并破坏CTLA-4跨功能轴。加入抗PD-L1阻断抗体来破坏PD-1/PD-L1的相互作用，也可以破坏PD-L1/B7-1的相互作用，并释放B7-1与CTLA-4结合，增强由B7-1/CTLA-4相互作用介导的抑制信号。此外，PD-L1/B7-1在APC上的顺式相互作用可以阻止CTLA-4介导的B7-1反式内吞。而抗PD-L1抗体可能通过破坏顺式PD-L1/B7-1相互作用，使APC上释放的B7-1与调节性T细胞(Tregs)上的CTLA-4相互作用，导致APC中CTLA-4介导的B7-1耗竭增强，B7-1介导的共刺激减少，从而对癌症免疫治疗产生负面影响。这些结果均表明，APC和肿瘤细胞上B7-1和PD-L1表达水平可作为正确选择靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4联合治疗的指导性生物标志物。
正如综述作者所总结，对PD-1通路的再理解对于免疫疗法未来的研发具有重要指导意义。首先，对PD-1/PD-L1相互作用结构特征的分析使得开发小分子拮抗剂阻止PD-1和PD-L1相互作用并与其他免疫治疗联合使用，以提高治疗成功率成为可能。
其次，由于PD-1及其配体不仅在T细胞上表达，也在髓系细胞上表达并影响着全身免疫反应，因此，针对该通路的临床前研究应全面评价先天和适应性免疫细胞的功能应答、分化特征和代谢过程，确定每个免疫亚群在这种全身反应中的精确作用可能会为检查点抑制剂联合治疗产生新的潜在靶标。这就是大家一直在追逐的“免疫精准治疗”。
此外，PD-1及其配体不仅在相邻细胞之间反式结合，也在相同的细胞表面呈顺式结合，后者可能帮助鉴别出更好的生物标志物，并指导实现诱导或抑制免疫应答的新策略。
对于PD-1通路来说，虽已功名在手，但仍留有余香。相信在科学界和产业界的共同努力下，花香沁鼻，指日可待。
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