非水解塑料——塑料生物氧化的跨学科研究
塑料的酶促转化最近已成为传统塑料废物治理技术的辅助以及替代手段。但是，目前聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚氯乙烯等商业塑料制品仍然不能被生物降解。详细了解酶的作用机制和影响这些的大分子因素对开发聚酯生物降解方法至关重要。将酶促降解技术应用于其他更难降解的塑料，我们仍需要进行更多研究。
发表在Trends in Biotechnology的文章“Non-Hydrolyzable Plastics–An Interdisciplinary Look at Plastic Bio-Oxidation”通过跨学科知识，探讨了物理化学因素对研究较少的塑料类型反应的重要影响。
01
我们对酶降解塑料的了解
面对不断升级的全球塑料废物的治理问题，研究人员和行业领导者更多地考虑将生物解聚和转化技术作为传统机械和化学回收方法的潜在辅助手段。这种生物技术在温和的条件下发挥作用，能够从混合基质中选择性地回收特定的单体分子，这种利用酶回收聚合物的方法可以增强和改进传统技术。
最近，主链结构含有杂原子的塑料，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚氨酯（PUR），这些底物通常被聚酯水解酶、角质酶、脂肪酶和羧酸酯酶降解。然而，占市场份额超过60%的最丰富和最有问题的塑料制品在很大程度上仍然被认为是不可生物降解的。这些聚合物包括聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚苯乙烯（PS）和聚氯乙烯（PVC），它们具有惰性的C–C主链结构，完全没有官能团（图1）。它们耐普通生物酶水解，只能通过高能氧化反应分解。这使得这些塑料制品极难被生物降解，到目前为止，几乎没有发现能很大程度上氧化这些高能结构的酶。
高阶基质效应已被反复揭示为决定可水解塑料中反应速率的主要因素。由于塑料制品在大分子结构上的相似性，我们假设这种效应同样适用于不可水解、更耐腐蚀的塑料。此外，我们引用其他非生物降解研究中获得的跨学科知识来推测酶机制的特征，旨在促进这一主题的更多基础研究。
图1.六种商业上最重要的塑料材料类型的市场份额（欧洲数据）
02
水解塑料降解过程中的聚合物物理
研究表明，可水解塑料的降解是通过细菌或真菌胞外的酶介导的典型表面侵蚀过程来进行的，其过程类似于天然聚合物的降解。致密疏水碳链网络阻止酶在底物基质中扩散，限制生物利用度并限制酶可接近的表面区域。由于酶在聚合物表面的吸附和酶-底物复合物的形成比水解反应本身慢，因此该吸附过程是这些塑料解聚反应的速率限制步骤。表面特性（如高疏水性）以及聚合物基质的高阶结构对降解动力学具有重要影响。
塑料中的高阶结构特征控制着分子链的流动性，这是塑料生物降解反应速率的一个重要决定因素。大分子链的迁移率由聚合物基质中的总自由体积决定，而聚合物基质中的总自由体积又受到非晶相与晶相的相对数量、分子侧链的刚性、支化量和温度的限制。
结晶度已被证实是限制PET降解的一个重要因素，通过几项研究，PET基质的结晶度从低纳米颗粒，到半结晶（24%），再到37%，通过各种酶升高底物结晶度，可以检测到降解速率的降低。
增塑剂的加入可以加速脂肪酶和角质酶对PET的酶降解。聚酯水解酶、角质酶和羧酸酯酶对聚酯裂解的研究表明，底物中对苯二甲酸酯与己二酸酯比率的增加可以抑制分子链柔性，分子链柔性的降低可以抑制降解。PET低聚物也显示了类似的结果，其中向聚合物混合物中添加流动性较小的结构域可显著抑制底物的水解和糖酵解。
在材料熔融温度或其玻璃化转变温度附近，分子迁移率的提高会显著加速酶降解。因此，热稳定性是PETase酶定点突变实验的主要目标。
这一证据支持链柔性假设的普遍有效性，迁移率的增加是由底物结晶度的降低、底物中结构域灵活度的增加以及反应温度的升高引起的（图2），当反应温度升高时，必须考虑酶的加速热失活。因此，聚合物物理在影响可水解塑料的酶降解反应速率方面起着重要作用。
图2.链柔性假说
03
不可水解塑料降解的证据
只有少数案例报告了能够解聚不可水解塑料PE和PS的特定酶。这些案例包括烷烃羟化酶AlkB、对苯二酚过氧化物酶、漆酶和漆酶介体系统（LMS）的报告。漆酶同时也参与木质纤维素的降解，木质纤维素是一种疏水性聚合物，含有长链惰性C–C键，类似于合成塑料。Krueger及其同事表明，木质素降解真菌可以分解水溶性PS模型化合物，并且对PS本身的攻击仅限于表面氧化。
一些报道表明，一些昆虫幼虫及其肠道微生物群可以有效地将PE和PS矿化为CO2。例如，黄粉虫幼虫，其肠道微生物能够降解和代谢麦秆中的木质素，能有效消化PS。它们能在16天内将近50%的聚苯乙烯泡沫塑料矿化为二氧化碳。随后，从幼虫肠道分离的菌株Exiguobacteriumsp. strain YT2可以降解底物PS，尽管在分离聚合物时表现出更慢的降解速率。此前，从蜡虫（Plodia interpunctella）分离的肠道细菌成功分解低密度聚乙烯（LDPE）薄膜，研究人员发现了肠道细菌降解塑料制品的证据。总的来说，整个生物体内的消化似乎比肠道细菌单独消化更有效。蠕虫消化机制引起的物理化学变化，如咀嚼导致碎片和表面积增加，可能在这一过程中起着重要作用。
04
不可水解聚合物的氧化反应原理
在不可水解聚合物中，催化降解、光降解、热降解和酶降解均通过自由基机制介导的基本自氧化过程来进行。这种自催化降解过程被认为是大多数碳氢化合物降解的共同过程，聚合物制造过程中残留的杂质或产物起到辅助作用。本自氧化方案包括起始、传播和终止步骤，有过氧化氢传播、氢提取、大分子自由基重排三个过程，并通过引入官能团和碳主链裂解最终导致聚合物降解（图3A）。。分子迁移率和结晶度对基本自氧化过程的结果有影响，有利于特定反应。
通过低分子量自由基片段的扩散或通过分子间和分子内的氢提取或交换，发生价迁移（图3B）。自由基反应的总平均活化能可通过物理迁移、化学迁移和最终反应的统计加权单个势垒确定。
图3.碳氢化合物聚合物中常见的自由基反应
05
候选酶
由于PE的单体结构没有任何官能团，PE的降解机制和烷烃的降解机制类似。因此，烷烃羟化酶/烷烃单加氧酶（AlkB）被认为是PE降解的候选酶。然而，它们的适用性受到限制，因为它们的活性位点只容纳相对较短的碳链，而且膜结合蛋白受到潜在表达水平的限制。
众所周知，诸如LMS等木质素降解酶对芳香族结构有效，因此特别是对于芳香族塑料PS的降解是有希望的候选。它们可以破坏木质素中的高能C–C主键。与烷烃羟化酶不同，LMS的活性不仅限于特定的官能团，而且需要与底物形成活性复合物。它们最近因表现出优越的稳定性和降解多种异源化合物的能力而备受关注。
在LMSs中，低分子量介质被漆酶氧化，成为一种强自由基中间体，可从酶中扩散出来，进而氧化底物。这不仅扩大了漆酶本身的催化范围，因为底物分子由于其较小的尺寸不需要进入活性位点，它也使底物基质中的介体分子具有较高的局部浓度。介体增加高氧化还原电位漆酶（HRPLs）的总氧化还原电位，相关木质素氧化酶的氧化还原电位高达1.5 V，使用H2O2作为共基质。大多数漆酶介质是含有N-羟基功能或一氧化氮自由基的有机化合物，可产生氧自由基。常用的介体包括ABTS、1-HBT和TEMPO以及天然化合物乙酰丁香酮、丁香醛和对香豆酸。一些介质显示出对不同基质的选择性，并且根据使用的介质的不同，反应机理可能不同，可以进一步探讨不同塑料类型的降解。
由于其所报告的稳定性，一些LMS在反应温度升高的情况下很有希望用于塑料生物降解使用靶向突变可以进一步增强LMS的特定有利特性。最近的方法使用了HRPLs突变体文库的创建以及各种定向进化策略中的筛选分析，包括经典自适应进化、一致性设计和嵌合体形成应用，并且一些酶系统的最适温度超过80°C。
类似的方法已被证明是成功的，人们发现各种用于降解PET的来自热裂菌的聚酯水解酶突变体。人为增强酶的热稳定性，使用更高的实验温度，从而提高PET降解率。最近的一份报告表明，耐热PET水解酶能够在10小时内将90%的PET解聚为单体，这是通过使用工程酶结合生物工艺环境来实现的。此外，一些氧化还原介质在生物催化反应中表现出很高的热稳定性。在使用天然氧化还原介质乙酰丁香酮对合成染料进行脱色的研究中，该酶以及该介质能够在70°C下培养2小时期间降解底物。
06
展望
PET的生物降解的进展为非水解塑料降解研究方向提供了一些有价值的线索。结构导向的进化提高了酶的有效性和稳定性，通过优化酶的表面性质和酶-底物的结合从而提高了生物利用度，工艺设计方法在理解反应机理和提高降解率方面上取得了长足的进步。因此，将多个学科的研究成果结合起来，有利于在未来更好地开发传统回收和再处理技术。我们需要进行更多的相关性研究，在生物系统中为解塑再用引入环境友好、资源密集度较低的替代循环经济方案。
供稿：卞峻岭
编辑：李晓萌 徐娅 张彤
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