【衡道丨干货】同步多重IHC：节约时间、金钱和患者组织的法宝
自从Coons及其同事关于冷冻组织中抗原的免疫荧光检测的革命性论文发表以来，免疫组织化学（IHC）在过去几十年间已成为解剖病理学实验室的常规，在经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的肿瘤或其他类型组织的组织切片中，单独鉴别出每种靶向抗原。
单标记IHC利用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶的标记能力，结合它们各自的反应物发色团，以产生可在光学显微镜下显现的比色染色。否则，通过与第一抗体的结合（直接免疫荧光）或通过附着到能够检测物种特异性的原发性的第二抗体上（间接免疫荧光），荧光色素可以呈现抗体-抗原的相互作用。
最近，病理实验室里的IHC已从单标记方法转变为多标记标记检测。多重IHC方法可以在单个组织样本中显现多个靶向抗原，并且可以同步或依次对它们进行进一步的细分。通常，如果使用的一抗来自相同的宿主物种，则需要连续多重IHC；否则，他们可以同时被着色和孵化。
为什么要使用多重IHC方法
因为同时显现多种抗原有许多优点。如果使用下一代测序和质谱法去检测单个目标分子，往往要破坏组织样本，而多重IHC可最大限度地提高从单个组织样本中获取的数据量——这对于保留宝贵的患者组织至关重要。多重IHC还允许用户检测组织结构中令人感兴趣的蛋白质的空间排列、相互作用和共生定位。
多重IHC方法相当复杂，为了得到最准确和可重复的诊断，需要经过适当培训的高技能人员来操作。在临床应用中，这些复杂的技术需要自动化，以便为不熟悉高级多路倍增方法的临床病理人员提供简单、有效且易于理解的结果。此外，随着多重IHC的诊断效用不断增强，组织学实验室将面临越来越多的需求，自动化（以及随之而来的标准化和稳定性）有助于达到满足这类需求所需的速度、质量和可重复性。
多重IHC用于诊断
早期采用多重IHC进行临床诊断的一个驱动因素是：泌尿科医生采用尽可能小的针进行前列腺活检，这导致病理人员很难可靠地诊断（或排除）小的癌症病灶；检查多个微小组织碎片非常耗时且诊断的可重复性差。最明显的临床需求是能够区分前列腺上皮内瘤变（PIN）和前列腺癌。我们还需要一种具备高度准确性和特异性的方法，以清楚地识别相邻前列腺组织的任何微浸润或微转移。当然，完成这一切的同时必须保存有限样本（前列腺针穿活检组织是组织的细丝）和缩短报告时间。
考虑到上述限制和需求，一种广泛使用的称为PIN-4的抗体混合物（参见图1）被开发出来。它包含一种或两种针对高分子量细胞角蛋白（CK HMW）的抗体，以及针对p63和p504S（也称为AMACR酶）的抗体。有研究表明，组合CK HMW [34βE12]，P63，和/或AMACR可能有助于将正常前列腺与PIN和前列腺腺癌区分开来。在前列腺组织中，CK HMW [34βE12]是正常腺体和PIN（PIN是前列腺腺癌的前体病变）的基底细胞的有用标记物，与此相反，浸润性前列腺腺癌典型地缺少基底细胞层。
p63是肿瘤抑制基因p53的同源物，已在正常前列腺的基底上皮细胞核中检测到，但是它不在前列腺的恶性肿瘤中表达。α-甲基酰基辅酶A消旋酶（AMACR），也被称为P504S，已被证明是前列腺腺癌的特异性标记物。此外，已发现前列腺上皮内瘤变的前列腺腺体中有表达AMACR，而在良性前列腺腺体中几乎检测不到该酶。
图1：用CK HMW + p63 + AMACR（RM）染色的前列腺癌。CK HMW的多重IHC检测加上前列腺腺癌活检中p63和AMACR的抗体。在显微照片的中间观察到强AMACR表达（红色）而没有相应的基底细胞层表达（缺乏CK HMW和p63 ，褐色），表明是浸润性PCa。仍然含有基底细胞的腺体（图像的上部和下部）显示出腺体周围连续基底细胞层丧失的迹象，表明前列腺上皮内瘤形成（PIN）。
病理学家在三个单独的载玻片上共定位三个单独的抗体信号（CK HMW + p63 + AMACR）时遇到很大困难。这在许多情况下被证明是不可能的，因为活检组织本身很小，当组织蜡块被切得更深以进行连续切片时，可疑的PIN或PCa区域更小，甚或不存在。然而，以多重IHC混合物形式将这些抗体应用于单个组织切片，能够同时对同一病灶中的这些关键标记物进行病理学评估，从而显著提高再现性。它还将浸润性前列腺腺癌的诊断准确性提高到可以确诊的程度——这就是为什么PIN-4显色已成为测试前列腺穿刺活检组织检查的标准。
多重IHC的临床应用已经扩展到其他组织，以提供增强的鉴别诊断信息。在乳腺癌中，ADH-5（CK5 / 14 + p63 + CK7 / 18）多重混合物（见图2）有助于鉴别常见导管增生（UDH），非典型导管增生（ADH）和原位导管癌（DCIS）。UDH携带的乳腺癌风险极小或没有增加，这些患者不需要接受任何其他手术；然而，ADH和DCIS分别在4-5％和8-10％的病例中发展为浸润性癌。建议ADH和DCIS患者接受切除手术，并为DCIS患者增加放射治疗。（研究表明，多达40％在活检组织中被诊断为ADH的病变在手术切除后重新检查后最终被归类为良性。）
UDH，ADH和DCIS之间的组织学差异鉴别在历史上是困难的，病理学家之间的一致性差，导致潜在的误诊和不当治疗。将ADH-5多重混合物添加到常规组织病理学测试中显著减少了ADH病变的过度诊断，将这些病变重新归类为UDH。有研究表明，多达40％在活检组织中被诊断为ADH的病变在手术切除后的再次检查中被归类为良性——这意味着所有这些患者在使用ADH-5多重混合物进行初始测试后，都可以避免不必要的手术。
图2：用CK5 / 14 + p63 + CK7 / 18染色的乳房病变。在乳腺病变活组织检查中多重IHC检测细胞角蛋白（CK5，CK14，CK7，CK18）和p63。乳腺基底细胞表达细胞角蛋白5和14（DAB；棕色），肌上皮细胞表达相同的细胞角蛋白和p63（DAB；棕色），并且管腔细胞表达细胞角蛋白7和18（红色）。左：在UDH中，多形性肿瘤增殖导致肌上皮/基底细胞与腔细胞混合，以显示异质的马赛克染色模式。右：ADH是一种单形瘤，通常来源于腔细胞，在受影响的导管结构上显示出均匀的染色模式，对肌上皮/基底细胞几乎没有染色。
多重IHC用于治疗决策
癌症治疗领域不断取得进展，我们为作出关键治疗决策而使用的诊断工具也是如此。眼下，免疫疗法越来越热门，针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或其配体(PD-L1)的一系列免疫检查点抑制剂已获得FDA批准用于治疗多种类型的癌症。然而，接受这些抑制剂治疗的患者中，高达60％的患者几乎没有任何益处。正确应用这些新设计的免疫治疗剂的一个关键是建立有效的预测性生物标志物以增强患者选择。
确定患者对免疫检查点抑制剂反应的一种建议方法是分析肿瘤微环境。免疫活性肿瘤微环境对患者对免疫治疗的应答至关重要。我们不仅要了解肿瘤的动态性质，还要确定其与微环境的相互作用，以确定预测对免疫检查点抑制剂反应的生物标志物算法。分析组织内的肿瘤微环境需要评估多种标志物，包括炎性细胞亚群，肿瘤浸润淋巴细胞和免疫检查点，多重IHC非常适合定义这些元素并阐述它们的相互作用。（参见图3）。
图3：用SOX10，PD-L1和CD8染色的黑素瘤。SOX10，PD-L1和CD8的多重IHC检测有助于确定黑素瘤中的高增殖区。在黑素瘤细胞中观察到SOX10核染色（蓝色），黑色素瘤的一个子集（左）显示PD-L1（+）膜表达（DAB；棕色）。高CD8细胞毒性T细胞染色（红色）与黑素瘤肿瘤细胞中的强PD-L1表达相关。SOX10 / PD-L1 / CD8三重染色可以帮助区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞，可能有助于定量或免疫评分以进行准确评估。
多重IHC的未来展望
为了最大限度发挥多重IHC的潜力，自动化是其发展的下一步。准确、一致、高质量染色结果对诊断实验室提出了大通量、高性能的要求，而且这些要求只会随着新型检测方法的发展而增加。反过来，实验室也将对其自动IHC染色平台提出更多的需求。
提高效率的创新——例如实施同步多重IHC的技术能力、联机脱蜡和节能并行的抗原回收——将使实验室能够满足上述要求，同时继续提供高质量的结果。随着我们越来越多地转向解剖病理学实验室的多路复用和自动化，我们将能够节省时间，金钱和宝贵的患者组织。
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