Nat Cell Biol | 康奈尔大学科学家David Lyden揭示外泌体的不同亚群并发现一种新的更小的外泌颗粒

外泌体是介导细胞间通讯的异质性纳米囊泡。康奈尔大学Weill Cornell Medicine科学家、外泌体与肿瘤领域大牛David Lyden最近发表在Nature Cell Biology的一项研究报道发现了一种新的细胞信使，可能有助于揭示癌细胞是如何利用人体细胞间的传递服务扩散到身体的新位置的。该研究利用一种尺寸分离策略鉴定了纳米颗粒的子类别，揭示了一种没有包封膜的亚型和囊泡成分的多样性，这表明尺寸并非是外泌体异质性的唯一驱动因素。

包含外泌体在内的胞外囊泡，已被认为是癌症进展的真正促进者，因为它们在来源细胞和邻近细胞以及远处组织之间发挥着通信媒介的作用[1,2]。过去五年来，这种交流机制的基础和所传达信息的性质一直在紧张研究之中。癌症来源的细胞外囊泡在肿瘤进展中的活性和特殊作用已被证实，包括与活性生物分子相互作用并将其转移到肿瘤微环境[3]。另外，已经证实了细胞外囊泡货物分选在疾病进展中的功能作用，并揭示了该机制[4]。外泌体分泌或生物发生的抑制也导致肿瘤细胞迁移受阻[5]，表明胞外囊泡的肿瘤促进功能可能是潜在的治疗靶点[3,6]。

在最新一期Nature Cell Biology杂志中，康奈尔大学威尔康奈尔医学院的通讯作者David Lyden教授与第一兼通讯作者Haiying Zhang等人报道了一种针对细胞释放的纳米级颗粒的不对称流场分离方法（asymmetric flow-fieldfractionation, AF4），可根据颗粒大小对细胞通讯环境中的这些组分进行分类[7]。这项研究证实了至少两个先前报道的外泌体亚类的存在，分别命名为小外泌体（Exo-S）和大外泌体（Exo-L），并且还确定了一类之前未被认识的纳米颗粒，称为exomere（我们暂译为“外泌颗粒”）[8]。这是一种直径约35 nm的离散且异常小的纳米颗粒，与外泌体相比，其表现出不同的蛋白质、脂质、RNA和DNA谱。

3种不同的细胞外纳米颗粒的形态

Zhang等人进行了深入的分子分析，以比较从相同细胞类型纯化的两种不同外泌体群体（大外泌体，Exo-L和小外泌体，Exo-S）的外泌体成分。他们的发现表明，外泌体亚群具有不同的生物物理学和分子学特性，这些特性与外泌颗粒（exomeres）不同。更具体地说，所有三种纳米颗粒都显示出不同的蛋白质组、脂质、RNA和DNA分布以及N-糖基化模式，表明它们可能来源于不同的生物发生机制。而且，一旦注入动物的血流中，三种颗粒也表现出不同的生物分布。因此，作者提出外泌体（exosomes）和外泌颗粒（exomeres）可能在细胞间通讯中发挥不同的功能。

B16-F10来源的大、小外泌体（exosomes）和外泌颗粒（exomeres）注射到小鼠血液后在小鼠体内的器官分布情况

可能在细胞外囊泡领域最引人注目的问题是纳米颗粒异质性的具体机制。细胞外囊泡的大小和成分的异质性现在普遍受到重视，文献中有大量证据[8,9,10]。另外，几个实验室已经发现了不同类型的微囊泡，如exophers、migrasomes和大的oncosomes [11,12,13]。通常推测这种多样性是不同的生物发生机制的结果[14]。然而，迄今为止只有少数细节揭示了外泌体的生物发生[15]。

细胞通讯环境中囊泡亚群的示意图。根据大小范围列出的不同的胞外囊泡，包括最新鉴定的外泌颗粒（exomeres）。外泌体的生物发生相对明确，较大的囊泡和外泌颗粒（exomeres）的生物发生目前是未知的。胞外囊泡含有来自细胞质、线粒体、高尔基体、质膜、内质网和细胞核的物质。EV, extracellular vesicle; MVB,multivesicular bodies。

Zhang等人进一步发现外泌颗粒（exomeres）富含参与代谢的蛋白质，特别是糖酵解和mTORC1代谢途径。这些结果表明外泌颗粒（exomeres）的生物发生涉及亚细胞器或与细胞代谢相关的活性，例如线粒体功能。他们推测受体细胞可能以代谢反应的形式解释这种外泌颗粒（exomeres）递送的信号。作者证实，外泌颗粒（exomeres）还富含与内质网、线粒体和微管相关的蛋白质，提示这些蛋白在外泌颗粒（exomeres）生物合成和分泌中的潜在作用。然而，这些类别的蛋白质之前已经归因于外泌体。另一个有趣的观察结果是外泌颗粒（exomeres）没有脂双层，它们富含某些类型的脂质，但与在Exo-S和Exo-L中发现的不同。另外，外泌颗粒（exomeres）和外泌体中的DNA包装因肿瘤类型的不同而不同，而RNA被Exo-S和Exo-L包装与其来源的肿瘤细胞无关。

纳米颗粒成分的分析不仅揭示了每个大小亚类之间的差异，而且还揭示了每个类别内的差异。以前，CD9、CD63、CD81、Tsg101和Alix1的表达被认为是外泌体的特异性标记。然而，在这项工作中，他们在Exo-L和Exo-S之间的分布非常不同，表明存在不止一种外泌体类群。这些数据符合之前报道胞外囊泡种群异质性的研究[8]。作者对颗粒成分进行的详细深入的分析表明，每个颗粒亚类都有明显的特定成分富集，可能表明不同的功能和特性。与Exo-S和Exo-L相比，外泌颗粒（exomeres）还富含酶，表明在影响靶器官细胞中的代谢程序方面有潜在作用，此外还包含与凝血和缺氧相关的蛋白质（例如因子VIII和X）。相反，Exo-S主要含有与胞内体、多泡体、空泡和吞噬囊泡相关的蛋白质，而Exo-L特异性地包含组成质膜、细胞-细胞接触或连接、晚期内体以及反面高尔基网的蛋白质。这些发现表明Exo-S最可能是真正的经典外泌体，例如源自内体腔室的腔内囊泡。相比之下，Exo-L可能代表不同的亚细胞来源的非经典外泌体或胞外囊泡，例如源自质膜出芽。

Exomeres、Exo-S和Exo-L的成分对比

虽然某个子类中的某些成分的富集表明生物发生和功能是共同的，但作者还揭示了不同细胞系的同一类型膜泡也呈现异质性。通过比较几种癌细胞系，包括乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤，Zhang等人证实即使每个细胞系含有三个纳米颗粒亚类，其货物组成也非常依赖于它们所来源的细胞系。虽然这一结果并不出乎意料，但它还证实，纳米颗粒亚群之间的异质性不仅受尺寸的限制，还受货物成分的驱动。考虑到货物在很大程度上将决定受体细胞对颗粒的响应，控制不同类型颗粒中货物组成的机制将是未来研究中关注的有趣问题。

这项研究最重要的意义之一是，它表明细胞外囊泡的异质性不仅由尺寸的变化来定义，而且也由每个尺寸等级之间和内部的成分变化来定义。虽然外泌颗粒（exomeres）是简单聚集分子而不是胞外囊泡的可能性并未排除，但是外泌颗粒（exomeres）含有复杂的大分子组成的发现证实了这样的假设，即外泌颗粒（exomeres）确实是一类独特的纳米粒子，但迄今为止还未知功能。如果这是真的，那么外泌颗粒（exomeres）为纳米颗粒通讯环境的异质性增加了另一个维度，确切地说，这可以改进对细胞通讯机制的理解并提供先前忽略的生物标记物。使用AF4发现外泌体的分类和外泌颗粒（exomeres）强调了这种技术的有效性以及揭示额外粒子群的潜力。这项研究的一个局限性是缺乏功能性实验。然而，成分的差异，特别是在N-糖基化方面的差异，在细胞外囊泡中很少被研究，这些差异高度表明可以在未来研究其功能差异。总的来说，这项全面的研究将为诊断、预后和治疗应用中的细胞外囊泡和颗粒的转化研究开辟新的途径。

由黑色素瘤肿瘤细胞分泌的外泌体（白色球状结构）和外泌颗粒（紫色和黄色）。该图像是使用原子力显微镜拍摄的。

“我们发现外泌颗粒（exomeres）是癌细胞分泌的最主要的颗粒，”Weill Cornell Medicine的儿科心脏病学教授、Sandra& Edward Meyer癌症中心以及Gale & Ira Drukier儿童健康研究所科学家、该研究通讯作者David Lyden博士说。“它们更小，结构和功能上与外泌体不同。外泌颗粒（exomeres）主要与骨髓和肝脏中的细胞融合，在那里它们可以改变免疫功能和药物代谢。后一个发现可以解释为什么许多癌症患者由于毒性而不能耐受小剂量的化疗。”

与直径在60至80纳米范围内的小外泌体（Exo-S）和直径为90至120纳米的大型外泌体（Exo-L）相比，外泌颗粒（exomeres）的直径小于50纳米。第一作者、Weill Cornell Medicine儿科细胞与发育生物学助理教授张博士说：“外泌体和外泌颗粒（exomeres）具有不同的生物物理特性，如刚性和电荷，这些特性可能影响它们在体内的行为。颗粒越硬，就越容易被细胞吸收，外泌颗粒（exomeres）比外泌体更硬，是将肿瘤信息传递给受体细胞的更有效的信使。”

外泌体和外泌颗粒（exomeres）在影响癌症的方式上也不同。外泌颗粒（exomeres）将代谢酶运送到肝脏，肝脏是药物分解成无毒形式的中心器官。这一发现表明，外源性靶向肝脏以“重新编程”其代谢功能以促进肿瘤进展。外泌颗粒（exomeres）还将凝血因子带入肝脏，在那里它们可能抑制肝脏调节凝血的正常功能。相反，研究表明Exo-L可能促进淋巴结转移，而Exo-S可能支持远处转移。

“癌症确实是一种需要多器官参与才能发展的全身性疾病，”Lyden博士强调。“我们发现肿瘤细胞分泌这三种不同的纳米颗粒，然后靶向不同器官中的细胞反映了这种疾病的这一重要方面。”

康奈尔大学已经提交了关于Nature Cell Biology论文中所描述技术的专利申请。研究人员将研究这些不同类型的信使如何发展，确切地说它们携带的分子以及它们在靶器官部位的功能。“了解这些特征可能会帮助科学家更好地理解外泌颗粒（exomeres）和外泌体如何帮助癌症生长并扩散到其它器官，以及它们在其他疾病中可能发挥的作用，”张博士说。

外泌体和外泌颗粒（exomeres）在体液如淋巴液中也可检测到，这可能允许生物标志物的发展用于癌症或其他病理状况的早期检测。“根据我们的研究结果，下一阶段将测量血浆样品中的外泌体和外泌颗粒（exomeres），以帮助预测肿瘤进展过程中可能靶向转移的器官，”Lyden博士说。“这将有助于我们更好地了解癌症生物学，指导治疗决策和开发新的治疗方法。”

“最后，我们开创的技术对于研究复杂纳米颗粒群体生物学的科学家和临床医生来说可能是一个有价值的工具，”张博士说，“并且可能有助于开发使用它们作为生物标志物的诊断测试。”

研究论文摘要

外泌体类群的异质性阻碍了我们对其生物发生、分子组成、生物分布和功能的理解。通过采用不对称流场分离技术（asymmetric flow field-flow fractionation, AF4），我们确定了两个外泌体亚群（大外泌体囊泡，Exo-L，90-120 nm; 小外泌体囊泡，Exo-S，60-80 nm），并发现了大量的非膜状纳米颗粒称为“外泌颗粒”（exomeres）（〜35 nm）。外泌颗粒（exomeres）的蛋白质组学分析显示富含代谢酶和缺氧、微管和凝血蛋白以及特定途径，如糖酵解和mTOR信号传导等相关的成分。Exo-S和Exo-L分别含有参与内体功能和分泌途径以及有丝分裂纺锤体和IL-2/STAT5信号通路的蛋白质。Exo-S、Exo-L和exomeres各自具有独特的N-糖基化、蛋白质、脂质、DNA和RNA谱以及生物物理性质。这三种纳米颗粒亚群表现出不同的生物器官分布模式，表明不同的生物学功能。这项研究表明，AF4可以作为分离细胞外囊泡和解决异质纳米颗粒亚群复杂性的改良的分析工具。

看该文中外泌体的电镜照片效果是不是特别棒？即便是没经过AF4分选的input效果是不是都特别好？所以，最后提一下该研究的外泌体提取方法，先看文章method部分怎么说的，

如图所示，依旧是用经典的超速离心的方法得到总的smallextracellular vesicles，即目前文献中称为的外泌体（绝大多数文献都是模糊处理，将这种复杂的异质性的小囊泡称之为外泌体），具体来说，他的参考文献41，我为大家找出来，首先，低速离心500g for 10 min，去除细胞、死细胞等；再高速离心20,000g for 20min，去除细胞碎片、大囊泡等；然后进行超速离心100,000g for 70min，得到富含外泌体的沉淀；resuspended in 20 ml of PBS进行清洗；最后进行第二次超速离心100,000g for 70min，得到外泌体。如果想要得到更加纯净的外泌体，在体系下面加40%的蔗糖垫，beckman超速离心机100,000g离心70min，然后再PBS重悬后超离清洗一次。

参考资料：

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