Nature | 脑肠轴的又一新证据——肠道菌调控交感神经节活动性
肠道菌调控宿主机体功能的研究一直是近年来的研究热点。最近这几个月来的主要进展包括，连续多篇Nature文章报道的肠道菌胆汁酸代谢物调控宿主免疫功能【1-3】（详见BioArt报道：Nature | 胆汁酸代谢物调节Th17和Treg细胞分化；Nature | 微生物的胆汁酸代谢物调节宿主肠道特异Treg细胞的稳态；Nature | 胆汁酸次级代谢产物促进结肠组织Treg细胞产生），以及报道肠道菌代谢产物影响他汀类药物疗效【4】（详见BioArt报道：特别关注Nature | 他汀类药物治疗或可阻止肠道菌群失调）或增加心血管事件风险【5】。此外，越来越多的证据表明，肠道和大脑存在着紧密联系，这也促生了一门新兴研究领域——脑肠轴。肠道菌调控神经系统功能的主要研究进展包括，肠道菌代谢物在小鼠自闭症模型【6】（详见BioArt报道：Cell亮点 | 惊！肠道菌群或是自闭症发病与治疗的关键环节；争鸣丨热门Cell被批的体无完肤—肠道菌群是自闭症发病及治疗的关键环节？知名博主质疑文章的可信度）或恐惧记忆消退【7】（详见BioArt报道：Nature | 菌群参与调控恐惧记忆消除）中扮演重要角色，此外，肠道菌还可生成神经递质来调控宿主线虫的行为【8】（详见BioArt报道：专家点评Nature | 线虫肠道菌产生神经递质调节宿主行为）。这些研究均揭示，肠道和大脑的联系具有重要生理意义。
肠道和大脑的联系不仅能调节小肠组织的局部活动，还能监测肠道微生物及膳食含量的变化【9】。然而，到底哪种信息可以将肠道微生物的状况递送给中枢神经系统，进而调节肠道生理，一直以来是一个未解的科学问题。外周神经系统中，自主神经系统(也称植物神经系统) 由交感神经系统、副交感神经系统组成 (亦有教科书将肠神经系统归为自主神经系统)。自主神经系统可支配平滑肌和多个腺体，从而调控内脏功能。对于消化系统而言，肠神经系统 (enteric nervous system) 是主要的内在神经系统 (intrinsic nervous system) ，被誉为机体的“第二个大脑”【10】。
外周组织相关神经元主要根据胞体的位置进行划分，可分为内源性 (intrinsic) 及外源性 (extrinsic) 组织相关神经元，前者的胞体在组织内，而后者的胞体在组织外。外源性肠相关神经元 (extrinsic enteric-associated neurons, eEANs) 包括感觉传入及自主传入两部分，可同时感受多处小肠状况，并将信息传递给组织，与内源性肠相关神经元 (intrinsic EANs, iEANs) 共同调节肠道功能。这一生理过程是如何受到中枢神经系统精准调控的呢？
为回答这一问题，2020年7月8日，来自美国洛克菲勒大学Daniel Mucida实验室的研究人员在Nature杂志在线发表题为Microbiota modulates sympathetic neurons via a gut-brain circuit的研究论文，通过使用揭示中枢和外周联系的神经环路研究技术，揭示了外源性肠相关神经元在识别肠道菌及其代谢物的作用。
首先，为鉴定eEANs神经元的胞体所在，研究人员使用逆行示踪工具CTB注射于小肠不同节段，并分离上游感觉结节神经节、背根神经节 (DRG) 及腹腔上肠系膜神经节 (CG-SMG) 的细胞(图1a)。随后通过使用翻译核糖体亲和纯化技术比较SPF及无菌小鼠的结节神经节的转录组，研究人员鉴定出了无菌小鼠相关的富集基因及通路，并发现无菌小鼠的CG-SMG神经元具有高水平的活动性。这一结果提示肠道菌的缺失能导致肠-外源性交感神经活动的显著增加(图1 i-j)。
图1. CTB逆行示踪鉴定出投射至小肠的肠交感神经元
那么，哪一类特定的肠道菌能介导CG-SMG神经元活动性的抑制呢？为回答这一问题，研究人员使用特定的肠道菌操控策略，将SPF小鼠的粪便转移给无菌小鼠，发现CG-SMG神经元活动性水平可恢复正常，而使用广谱抗生素耗竭肠道微生物能增加CG-SMG神经元活动性，这些结果均提示肠道菌能调控肠外源性交感神经元活动性 (原文图2) 。而这些被肠道菌激活的肠外源性交感神经元是否直接投射到小肠呢？研究人员在FosGFP小鼠上使用逆行示踪，并结合广谱抗生素来激活神经元活动性，发现投射交感神经元与cFos具有较大程度的共定位，提示抑制肠道菌可激活投射到小肠的交感节神经元。随后，研究人员也鉴定了短链脂肪酸 (SCFAs) 及其他肠道相关的代谢物、激素因子作为肠交感神经激活调控因子的机制 (详见原文补充数据图3-4) 。
既然鉴定出了CG-SMG交感神经元的活动性能被肠道菌耗竭所激活，那么上游存在哪些特定神经元调控交感活动性呢？使用跨多级突触的伪狂犬病毒 (PRV) 逆行示踪工具，研究人员鉴定出了多个投射到小肠的脑干核团 (图2) ，并推测GABA能抑制性神经元及谷氨酸能兴奋性神经元可能主要参与肠交感神经元的调控。结合PRV示踪与特定神经元荧光标记的转基因小鼠，研究人员鉴定出巨细胞神经元大部分为GABA能投射，而外侧巨细胞旁核 (LPGi) 及腹外侧延髓头端 (RVLM) 神经元为谷氨酸能投射。鉴定出这些脑干核团投射的性质是后续功能操控实验的重要基础。
图2. 伪狂犬病毒逆行示踪技术鉴定出投射至小肠的脑干核团
肠交感神经的支配对于控制肠道血流流速、肠蠕动性及上皮细胞分泌具有重要意义【11】。为研究上游脑干核团调控肠交感神经元的功能，研究人员使用FosTRAP小鼠结合伪狂犬病毒工具来标记抗生素耗竭后被激活的神经元，确定了LPGi及RVLM脑干核团可以被肠道菌耗竭所激活。使用化学遗传技术 (DREADDs) 操控脑干核团的这些神经元可直接调控肠交感神经活动性，表现在激活这类神经元可减缓肠运输及粪便排出。这一实验证明LPGi及RVLM脑干核团的谷氨酸能神经元可驱动肠交感神经活动性，并减缓肠运输。研究人员还鉴定出了其他脑干区域，主要包括背测迷走神经复合体 (DMV、NTS、后级区等)。
最后，研究人员通过抑制结节神经节和背根神经节活动性来操控肠道传入神经元的投射，发现背根神经节的感觉传入神经元不是肠道菌耗竭所主要激活的神经元。对结节神经节的转录组分析表明编码Nav1.5通道的基因Scn5a在结节神经节的神经元中富集，这也被后续其他实验所佐证。因此，研究人员通过化学遗传技术、示踪技术、损毁技术及转录组分析共同证明了存在特定的迷走传入神经元来驱动肠交感神经活动性。有意思的是，在脑干核团LPGi及RVLM注射伪狂犬病毒，研究人员意外发现了这些脑区接受来自结节神经节的投射，证明了“肠–脑–肠”环路的存在 ：肠道微生物及其代谢物可调控肠交感神经元的激活，而特定脑干感觉核团可整合肠道特定刺激。
图3. 使用多级示踪技术鉴定出了“肠–脑–肠”环路的存在
综上所述，本文通过一些列功能、环路及基因表达研究，证明了外源性肠相关神经元在识别肠道菌及其代谢物的作用，其中，肠道菌组成的改变足以激活肠投射神经元(图4)。此外，交感神经系统所释放的信号也可影响基因转录水平的改变。未来进一步的研究需要阐明CG-SMG神经节对其他靶器官如脾脏、胰腺及肝脏等的调控机制。
参考文献
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[6] Sharon G, Cruz NJ, Kang DW. et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell, 2019, 177 (6): 1600-1618 e17
[7] Chu C, Murdock MH, Jing D, et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature, 2019, 574 (7779): 543-548
[8] O'Donnell MP, Fox BW, Chao PH, et al. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature, 2020 (in press)
[9] Furness JB, Rivera LR, Cho HJ, et al. The gut as a sensory organ. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2013, 10, 729–740
[10] https://www.scientificamerican.com/article/gut-second-brain/
[11] Browning KN and Travagli RA. Central nervous system control of gastrointestinal motility and secretion and modulation of gastrointestinal functions. Compr Physiol, 2014, 4, 1339–1368