PNAS-单体药理Q1:雷公藤甲素抑制IDH1突变的恶性肿瘤-通过Nrf2驱动的谷胱甘肽代谢
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【期刊信息】
小类：MULTIDISCIPLINARY SCIENCES(综合性期刊) 2区
【题目及作者信息】
Triptolide suppresses IDH1-mutated malignancy via Nrf2-driven glutathione metabolism
【摘要】
异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变是人恶性肿瘤中常见的基因异常，其特征是显著的代谢重编程。研究显示IDH1突变细胞显示出更高的活性氧水平和对Nrf2引导的谷胱甘肽从头合成的更高需求。结果表明，雷公藤二萜环氧化物雷公藤甲素是一种有效的Nrf2抑制剂，在体内外对IDH1突变的胶质瘤细胞具有选择性细胞毒作用。从机制上讲，雷公藤甲素抑制了GCLC、GCLM和SLC7A11的表达，扰乱了谷胱甘肽代谢，利用IDH1突变体新形态活性产生的活性氧导致合成性致死。雷公藤甲素通过靶向Nrf2驱动的谷胱甘肽合成途径是治疗IDH1突变恶性肿瘤的一种有价值的方法。
【前言】
核因子样2（NFE2L2，Nrf2）是真核细胞中控制抗氧化途径的转录因子。Nrf2在IDH1突变的胶质瘤中起着关键的保护作用，并支持肿瘤的发生，然而目前仍没有理想的Nrf2化学抑制剂。本研究中，作者证明了雷公藤甲素，一种来自雷公藤的二萜环氧化物，在患者来源的IDH1突变细胞和临床前异种移植模型中显示出较强的选择性抑制作用。从机制上讲，雷公藤甲素降低了Nrf2与谷胱甘肽代谢必需调控基因的启动子区域的亲和力，如GCLC、GCLM和SLC7A11。干扰谷胱甘肽的从头合成，在IDH1基因突变的细胞中建立具有内在氧化应激的合成性致死，从而导致大分子的氧化（如DNA氧化损伤和脂质过氧化），最终产生细胞毒性抑制肿瘤。
【结果部分】（源自 先导活性分子研究小组）
1.IDH1突变细胞的氧化应激升高
为研究IDH1突变细胞的氧化还原动态平衡，以U251 MG细胞系为基础通过多西环素诱导建立IDH1突变细胞。在IDH1突变酶（IDH1R132C或IDH1R132H）被诱导后24 h观察到细胞内活性氧（ROS）显著积聚（Fig. 1A）。通过活细胞成像观察氧化脂质积聚，结果IDH1突变后脂质氧化显著升高（Fig. 1B,C）。进一步对患者来源的脑肿瘤起始细胞（BTIC）中的氧化应激进行研究结果与之前一致，与IDH1野生型BTIC的GSC827和GSC923相比，IDH1突变BITC（TB096和TS603）的ROS积聚增加（Fig. 1D），IDH1突变的BTIC中也观察到明显的脂质过氧化（Fig. 1E,F）。最后，H2DCFDA流式细胞术分析证实了IDH1突变的BTIC中细胞内ROS的积累（Fig. 1G,H）。在外源性过氧化氢清除剂过氧化氢酶存在下，IDH1突变细胞的氧化应激升高是可逆的。
2.Nrf2调控的谷胱甘肽合成途径在IDH1突变细胞中上调
细胞氧化应激受到Nrf2基因转录的严格调控。与细胞氧化应激的升高相一致，通过ARE荧光素酶报告实验作者观察到在IDH1诱导的U251细胞和患者来源的BTIC中Nrf2的转录活性增强。携带IDH1突变的细胞表现出2-3倍高水平的Nrf2转录活性（Fig. 2A,B）。染色质免疫沉淀实验（ChIP）的结果进一步证实了这一发现，在IDH1突变细胞中，Nrf2与抗氧化基因的启动子区域具有更高的亲和力，如GCLC、GCLM、SLC7A11和NQO1（Fig. 2C）。此外，基因表达分析表明，IDH1突变的BTIC TS603中，ROS清除基因表达上调，表明Nrf2介导的抗氧化途径被激活。值得注意的是，半胱氨酸-谷氨酸逆向转运体xCT（SLC7A11）在IDH1突变的BTIC中上调最显著，与IDH1野生型BTIC相比增加了7倍（Fig. 2D,E）。最后，免疫印迹证实在IDH1突变的U251细胞和BTIC TS603细胞中，SLC7A11的蛋白表达显著上调（Fig. 2F）。
3.谷胱甘肽（GSH）从头合成支持IDH1突变细胞的细胞内稳态
xCT半胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(SLC7A11)是一种钠依赖的异源二聚体氨基酸转运蛋白，主要负责输入半胱氨酸和输出谷氨酸。一些标志性的研究表明，SLC7A11通过内化微环境中的半胱氨酸来促进谷胱甘肽的从头合成。为了解SLC7A11在IDH1突变细胞中的作用，作者研究了IDH1突变细胞中谷胱甘肽和氧化还原状态的变化情况。siRNA抑制SLC7A11的表达时，细胞内GSH/GSSG比值和GSH总量均显著降低（Fig. 3A）。此外，SLC7A11基因沉默导致IDH1突变细胞脂质过氧化增强（Fig. 3B,C）。ROS定量分析证实，SLC7A11的表达缺失导致IDH1突变细胞中ROS大量积聚（Fig. 3D）。此外，SLC7A11的基因沉默导致IDH1突变细胞的凋亡增加，而野生型IDH1的细胞中没有发现这种现象（Fig. 3E,F）。这些发现表明SLC7A11在支持谷胱甘肽从头合成中发挥重要作用，谷胱甘肽从头合成能保护IDH1突变细胞免受细胞凋亡。
4.雷公藤甲素是强效Nrf2抑制剂，影响谷胱甘肽的合成
考虑到谷胱甘肽从头合成在IDH1突变的胶质瘤细胞中的关键作用，靶向Nrf2/SLC7A11轴可能对这种类型的恶性肿瘤有效。已报道了一些Nrf2或SLC7A11化学抑制剂，如植物来源的类胡萝卜素(Brusatol)已被报道对Nrf2有很强的抑制作用，但其大分子量和毒性特征阻碍了其进一步临床应用。作者发现来自雷公藤的二萜环氧化物雷公藤甲素在纳摩尔水平对ARE驱动的转录活性显示出很强的抑制作用（Fig. 4A）。ChIP实验证实雷公藤甲素显著降低了Nrf2对GCLC、GCLM、SLC7A11和NQO1启动子区域的亲和力（Fig. 4B）。TS603中的基因表达分析表明，大多数Nrf2下游基因都受到雷公藤甲素的影响，表明雷公藤甲素是一种广谱的Nrf2基因转录抑制剂（Fig. 4C）。雷公藤甲素处理后，IDH1突变的BTIC TS603和TB096的SLC7A11 mRNA水平下降，但IDH1野生型BTIC的mRNA水平没有变化（Fig. 4D）。类似地，雷公藤甲素对IDH1突变的BTIC TS603和TB096的Nrf2转录活性有明显的抑制作用（Fig. 4E）。
5.雷公藤甲素诱导IDH1突变细胞的氧化损伤
为进一步分析雷公藤甲素对IDH1突变细胞的影响，作者测定了雷公藤甲素处理下BTICs中谷胱甘肽水平。在IDH1突变的BTIC TS603细胞中，雷公藤甲素可使GSH/GSSG比值和谷胱甘肽总量减少，但对IDH1野生型GS827和GSC923细胞的影响很小（Fig. 5A,B）。GSH池的耗竭与ROS大量提高、显著的脂质过氧化相一致（Fig. 5C-E）。此外，在IDH1突变的细胞中，ROS的积累转化为氧化损伤。DNA电泳和彗星试验显示，雷公藤甲素诱导的IDH1突变细胞出现DNA损伤和DNA片段化，而IDH1野生型细胞对相同处理的反应最小（Fig. 5F-H）。作者还通过8-oxoG升高、PARP切割和γH2A.X染色证实了IDH1突变细胞的DNA损伤和DNA片段化（Fig. 5I,J）。
6.雷公藤甲素对IDH1突变细胞具有选择性细胞毒作用
与氧化损伤的增加一致，雷公藤甲素有效地抑制患者来源的IDH1突变的胶质瘤细胞。EDU掺入实验证实雷公藤甲素使减少了75%IDH1突变细胞的增殖，而在IDH1野生型细胞中减少幅度很小（Fig. 6A,B）。肿瘤球形成实验表明公藤甲素处理显著减少了IDH1突变细胞的球体大小和数量，但对IDH1野生型细胞没有影响（Fig. 6C,D）。有限稀释法显示IDH1突变的BTIC TS603细胞集落形成能力降低（Fig. 6E, 纵坐标0.37时，DMSO = 33个/孔，雷公藤甲素 = 196个/孔），但IDH1野生型BTIC GSC827细胞不降低（纵坐标0.37时，DMSO = 58个/孔，雷公藤甲素 = 63个/孔）。Caspase3/7活性测定表明，雷公藤甲素诱导IDH1突变细胞发生明显的凋亡，而ROS清除剂过氧化氢酶可以挽救这种凋亡（Fig. 6F）。类似地，经雷公藤甲素处理后，Annexin V/PI流式细胞术检测到IDH1突变细胞比IDH1野生型细胞有更多的凋亡细胞，此外，过氧化氢酶联合处理可降低细胞毒性（Fig. 6G,H）。这些发现表明氧化还原稳态的破坏是细胞增殖减少和凋亡细胞死亡的主要原因之一。此外，细胞活力分析显示，IDH1突变细胞对雷公藤甲素的IC50值为15 nM，而IDH1野生型细胞的IC50值为60 nM（Fig. 6I），表明雷公藤甲素对IDH1突变细胞有更强的细胞毒性。
7.雷公藤甲素通过Nrf2驱动的谷胱甘肽代谢治疗IDH1突变恶性肿瘤
体外研究结果表明，雷公藤甲素通过Nrf2驱动的谷胱甘肽合成途径对IDH1突变的胶质瘤细胞产生有效的细胞毒作用。作者建立了建立了IDH1突变的胶质瘤异种移植模型，与溶剂对照相比，雷公藤甲素显著抑制了TS603异种移植瘤的生长（Fig. 7B-D）。此外，免疫组化染色显示雷公藤甲素抑制Nrf2和谷胱甘肽代谢相关基因的表达，如SLC7A11、GCLC和GCLM（Fig. 7E）。雷公藤甲素处理的异种移植组织中，还观察到增殖标记物Ki67降低、DNA损伤标记物γH2A.X升高，TUNEL信号增强则提示雷公藤甲素诱导细胞凋亡（Fig. 7G,F）。最后，通过异种移植模型作者发现雷公藤甲素对患者来源的idh1突变的颅内肿瘤有很强的抑制作用（Fig. 7H, 总生存期: TS603, PBS=68d, Trip=82d, *P=0.0115; BT142, PBS=67d, Trip = 80.5d, **P = 0.0062）。相反，雷公藤甲素对两种IDH1野生型异种颅内移植物的预后影响都很小（总生存期: GSC827, PBS=101.5d, Trip=102.5d, P=0.6979; GSC923, PBS=99d, Trip = 102d, P = 0.4415）。总体而言，原位临床前模型的数据表明了雷公藤甲素对IDH1突变恶性肿瘤的治疗效果。
【结论与讨论】
阐述了中药雷公藤中的活性成分雷公藤甲素通过Nrf2/SLC7A11轴影响谷胱甘肽合成影响诱导IDH1突变细胞氧化损伤从而抑制IDH1突变的恶性胶质瘤。为中药活性成分的靶点研究提供了参考，但其在IDH1突变和野生型中的IC50值相差仅4倍可能导致治疗窗口较窄。
总体而言，本研究提供了一项概念验证的临床前研究，表明雷公藤甲素作为 IDH1 突变恶性肿瘤的选择性治疗的潜在价值。然而，雷公藤甲素诱导的 Nrf2 阻断机制尚不清楚，以及雷公藤甲素的特异性不确定等局限性仍需进一步研究。还应验证副作用和血脑屏障渗透，以将我们目前的研究转化为临床应用。