综述：小麦小种专化型抗病性由NLR免疫受体与多种非NLR蛋白控制
近些年在大规模测序，基因组和快速基因分离技术等方面的进展，加速了小麦，大麦，黑麦和它们的野生近缘种中小种专化型抗病基因（R基因）及与之对应的无毒基因（Avr基因）的鉴定。本文对已鉴定的R和Avr基因进行了汇总，发现大量的编码小种专化型抗病性的基因不是经典的NBS-LRR蛋白。具有独特结构域的免疫受体控制小种专化抗性揭示了寄主-病原菌生物互作的新方面。我们得出结论：多倍体作物基因组有很大的进化潜力产生多样类型的抗病基因。
植物对适应性病原菌侵入的响应主要有两种形式。小种专化型（Race-specificresistance）抗性：对一些病原菌生理小种提供主要的完全抗病性，由单个R基因控制。只有在R基因和对应的Avr基因同时存在时表现抗病性。相反，非小种专化抗性对所有生理小种提供部分，数量抗性（quantitativeresistance，QR），抗性表达不依赖于Avr基因的存在。QR延缓病害发展，并且几个数量性状位点可以聚合提供抗性。其中一些位点具有主效作用，例如多抗位点Lr67/Yr46和Lr34/Yr18/Pm38，或者抗赤霉病基因Fhb7。除了小种专化的R基因和QR基因外，还有感病基因，像大麦Mlo基因，Mlo基因的功能缺失突变体对所有的大麦白粉菌株表现隐性遗传抗性。
不同类型的植物免疫受体识别不同的病原菌分子模式进而启动不同的防御反应最后进入共同的信号通路。模式识别受体PRRs（Pattern recognition receptors，类受体激酶或类受体蛋白）,识别保守的病菌相关（或微生物相关）分子模式，启动PTI（pattern-triggered immunity）诱导抵抗非适应性病原菌的防卫反应。PTI的残余水平被认为对适应性病原菌提供基础抗性，因此，将PTI归类于非小种专化型抗性。在小麦中，尽管已经有一些候选基因被分析出来，但是仍然有大量的PRRs没有被鉴定。大多数小种专化的R基因编码NBS-LRR免疫受体，可以识别病原菌菌株特异的effector（效应因子），从而引发免疫反应，有效的阻止病原菌的传播。
主要作物中，已经在遗传上鉴定到上百个R基因，这些基因在作物抗病育种中仍然起着主要作用。近些年高质量基因组及伴随的新的基因克隆策略大大促进了R基因的克隆，为扩大作物抗病多样性提供了切实的机会。这里，我们聚焦于近些年在小麦，大麦，黑麦和野生近缘种中小种专化型抗性基因的分子鉴定进展。这些基因不仅包括编码NLR蛋白的经典的R基因，还有不断增加的具有特有结构域的新的免疫受体，可能揭示了寄主-病原菌互作的新方面。重要的是，这一类抗性基因不与一个特定的分子特征相关，而是基于表型和遗传的鉴定。
早在基因被克隆之前，抗性基因就已经通过表型和遗传学研究被识别出来。它们在作物育种计划中被广泛使用，并且仍然是抗病性的重要来源。在小麦中，已知有几百个基因用于抗击三种锈病（叶锈病、茎锈病和条锈病）以及白粉病。术语'抗性基因 '已被用来描述在一个物种中使抗性和易感性基因型之间存在关键区别的多态性遗传元件。在分子水平抗性基因的产物常常(直接或间接地)识别病原体的存在，但这不是必需的。例如，一个参与抗性基因上游的非多态性基因可能检测病原体的分子，而信号转导与防御反应诱导所需的下游基因的存在与否可能决定一个基因型是否具有抗性，这个下游元件将被称为抗性基因。它在作物物种的基因库中是多态的，而感知病原菌的上游成分，如NLR蛋白，可能是非多态的。因此，并不是所有的R基因都必须编码典型的的免疫受体，如NLRs或类似受体的蛋白质，而且小种特异性并不取决于特定的蛋白质结构，如NLR。本综述中描述的非NLR蛋白中，目前大多数都不知道它们如何提供小种特异的抗性，它们是否是免疫受体，是信号级联中的下游元件或具有其他分子功能。可以期望，对这些基因的功能研究将会揭示出植物抗病性的新的生物学方面。
越来越多的小麦、大麦和黑麦抗性基因已经被分子分离出来，包括来自野生近缘植物的基因，这些基因在小麦中具有功能性（表1）。它们大多对真菌性疾病有活性，但也能赋予对蚜虫的抗性。一些从黑麦染色体引入到了小麦中的黑麦基因已经被克隆，这也揭示了同一NLR基因簇的成员已经演化为小麦（Sr33）和黑麦（Sr50）的抗秆锈病基因或大麦和小麦（Mla等位基因系列）的抗白粉病基因，表明了关于保守效应因子功能和识别的有趣进化意义。根据40个已经克隆的R基因，我们估计大约85%的小麦小种特异型抗性基因编码NLRs。然而，这可能是一个高估，因为分子鉴定的重点是用于育种的基因，不包括古老的地方种或非驯化小麦的基因，以及可能对育种不太有用的特异性较窄的基因。为了研究NLR与病原体分子的相互作用，最近已经分离出几个无毒基因（表1）。然而，无毒基因的鉴定落后于抗性基因。
在栽培品种中国春的参考基因组中，共检测到3400个全长的NLR位点，其中1560个位点表达了完整的开放阅读框。通过比较10个来自不同小麦骨干品种的高质量基因组估算小麦的泛'NLRome'，即基因库中NLR编码基因的完整多样性。在所研究的10个基因组中，只有31%-34%的NLR基因在所有的基因组中共有，而品种独特的NLR基因数量从22到192不等。此外，据估计，10个小麦基因组中的NLR基因占小麦基因库中存在的所有NLR基因的约90%左右，估计由5905至7780个独特的NLR基因组成。因此，理论上小麦中基于NLR的小种特异型抗性基因（不包括等位基因变体）的最大数量约为7000个，其中已被描述的基因不到10%。然而，小麦泛 'NLRome '可能比这更大，在10 小麦泛基因组中选出的品系很好地涵盖了全球骨干小麦栽培品种的遗传多样性，但它们可能并不代表地方种以及小麦二倍体和四倍体基因组中存在的完整多样性。
一些NLR基因具有独特的功能，但只是部分的被了解。例如，Sr21基因的表达以及抗性表型都随着温度的升高而增加。此外，Sr21的表达和抗性在具有D基因组的小麦基因型中较低，在栽培品种 “Canthatch”中也观察到了同样的现象。然而，目前还不知道被抑制的秆锈病抗性基因是否编码NLR。“Canthatch”的D基因组上的抑制因子被确定为中间复合物的一个亚单位，该复合物在真核生物中是保守的，可以调节基因表达。小麦中的同源物在蛋白质水平上抑制黑麦NLR基因Pm8的作用，这种机制可能是导致从二倍体或四倍体小麦近缘属中引入普通小麦的基因经常被抑制的原因。
除了在典型的NLR蛋白中发现的结构域外，一些小麦和大麦NLR含有可能参与受体激活或下游信号传导的整合结构域（IDs）。这些嵌合基因中的一些是古老的，它们起源于草系的物种化之前。例如，水稻含有带有锌指BED结构域的NLRs。在小麦中，最近克隆了两个编码ID-NLRs的活性抗性基因。首先，小麦条锈病抗性基因Yr5、Yr7和YrSP编码的蛋白质N端具有非经典的锌-指BED结构域。BED结构域取代了经典NLR蛋白中的CC结构域，它后面跟随NB-ARC和LRR结构域。突变体分析表明，BED结构域对抗性至关重要，并且在由Yr5、Yr7和YrSP基因编码的BED-NLR蛋白间显示出高度的序列保守性，这意味着BED结构域在蛋白功能中起着主要作用。此外，每个基因都有不同的识别特异性，这可归因于C端LRR结构域的大量多态性。因此，我们推测BED-NLR蛋白的小种特异性与典型NLR蛋白的方式相似（图1）。
小麦YrU1基因编码一个C端和N端都有ID结构域的ID-NLR蛋白，一个N端锚蛋白（ANK）重复和一个C端WRKY结构域。这种类型的ID-NLR蛋白只在小麦相关物种中发现，它通过CC和ANK结构域在有机体内和植物体中进行自我关联。WRKY结构域是一个推测的转录结构域，可能参与识别条锈病效应因子以激活免疫反应，与拟南芥抗性蛋白复合物RPS4/RRS1相似（图1）。
四个麦类抗性基因，大麦秆锈病抗性基因Rpg1，小麦条锈病和秆锈病抗性基因Yr15和Sr60，以及小麦白粉病抗性基因Pm24，编码由两个串联激酶（或假激酶）结构域组成的抗性蛋白。所有这些TKPs都属于丝氨酸/苏氨酸非RD（非精氨酸-天门冬氨酸）激酶，之前被证明通过两个激酶结构域之间的融合或重复进化参与植物免疫。根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的保守残基的存在（图2），两个激酶结构域中至少有一个具有功能。此外，突变体和转基因分析表明激酶和假激酶结构域都是保持抗性所必需的。
TKP介导的抗性与过敏反应（hypersensitive response，HR）相关，是由效应因子触发的类抗性反应的免疫。Yr15和Rpg1是细胞膜蛋白（图1），这表明它们是识别胞内效应因子。这些基因表现出不同的抗性谱。Sr60仅对一些测试的（少数）小麦秆锈菌生理小种具有抗性，而Yr15被证明对几十个遗传和地理上不同的条锈菌生理小种均有抗性作用，Pm24对93个中国Bgt分离菌株表现抗性。此外，Rpg1在跨越几十年的田间条件下提供了显著的持久抗性。因此，Yr15和Rpg1被认为不属于条锈病小种专化型的抗性基因。然而，近些年已经发现一些生理小种能够克服Rpg1和Yr15介导的抗病性。因此确定TKP编码基因是小种特异型抗病基因。在TKP编码基因中很少有多态性等位基因的报道，这与典型的NLR编码R基因相反，R基因有多个功能性等位基因和快速多样化的抗病基因簇。
有趣的是，Yr15导入系显示出不同的抗性表型，说明基因功能的表现受遗传背景的影响，存在其它的遗传元件在TKP介导的抗性途径中起作用。在野生番茄种群中的Pt介导的抗性中也观察到了类似的情况， Pto抗性等位基因变异识别相应的AvrPto基因（图1）。在此，我们认为一些Pto介导的抗性反应途径中的遗传元件发生功能故障会导致抗性变异。
TKP蛋白含有一个与Pto和PRRs具有很强同源性的丝氨酸/苏氨酸特异性的激酶结构（图2）。在番茄中，Pto与NLR蛋白Prf一起发挥作用赋予对细菌病原体的抗性。可能是由于参与TKP介导的抗病性的未知遗传成分的功能“存在/不存在”导致Pto的抗性反应多种多样，以及受遗传背景的影响。在Rpg1介导的抗性中，E3泛素连接酶SCF（Skp1-cullin1-F-box）复合体成分似乎参与了抗性过程，很可能还有其他遗传成分调节TKP介导的抗性。新的假说认为：假激酶结构域作为效应因子的诱饵，在与效应因子相互作用后，假激酶的激酶结构域被激活，使下游元件磷酸化，从而激活抗性反应（图2）。显而易见，对TKP介导的抗性途径的阐释还需要更多的研究工作被执行。
WAKs是具有细胞外半乳糖醛酸结合结构域、跨膜结构域和细胞质丝氨酸-苏氨酸激酶结构域的类受体激酶，具有包括病原菌抗性等一系列生物功能。小麦Stb6基因通过检测相匹配的非原质体的效应因子的存在，以基因对基因的方式赋予小种特异型的抗性，而没有HR反应的发生（图1）。这与之前具有病原菌抗性的WAKs不同，如玉米Htn1基因对北方玉米叶枯病赋予的部分数量抗性。在一个反向的基因对基因的相互作用中，小麦WAK编码的Snn1基因被坏死性毒素SnToxA所劫持，该毒素直接被Snn1蛋白识别（图1）。SnToxA以及Stb6识别的AvrStb6都是蛋白质，这表明WAK蛋白受体除了识别寡半乳糖苷配体外，还能识别蛋白质效应因子。最近对rcs5的克隆发现了两个紧密连锁的基因Sbs1和Sbs2，它们编码两个WAK蛋白，是大麦半知菌病原体Bipolaris sorokiniana的感病靶标。在谷物基因组中，编码WAKs的基因很丰富，需要更多地研究它们对作物的小种特异型以及数量抗病性的贡献。
谷物中无偏的基因分离策略的发展，如MutChromSeq，导致了对具有独特的、以前未知的结构域的免疫受体的分子鉴定。赋予小麦叶锈病抗性的Lr14a基因编码一个嵌合蛋白，该蛋白有一个N端锚蛋白（ankyrin）重复结构域和一个C端跨膜结构域，其蛋白序列与拟南芥ACD6蛋白同源。Lr14a还显示出与人类瞬时受体电势ANK通道的相似性，后者是Ca2 渗透性的非选择性阳离子通道（图1）。Pm4基因编码一个丝氨酸-苏氨酸激酶和多个C2结构域和跨膜结构域的嵌合蛋白。Pm4的功能分析显示，由组成型可变剪接产生的两个蛋白变体是抗性所需要的，这两个编码的蛋白变体在生化上相互作用，形成一个内质网相关复合物（图1）。Pm4与拟南芥质膜蛋白具有同源性，说明还未鉴定的AvrPm4效应因子可能是在质膜上被识别的。Lr14a和Pm4无疑将揭示实现小种特异性植物免疫的新型分子机制。
与研究相对透彻的NLR-效应因子的相互作用相比，对非NLR的小种特异型抗性的分子研究还处于早期阶段。对相应的病原体无毒基因的分离工作非常关键，这能够帮助我们确定寄主的目标并了解它们与抗性基因的关系。AvrStb6是唯一已知的对应于非NLR蛋白的无毒基因。它具有典型的短小、分泌蛋白的特征，与已知的蛋白没有同源性，与NLR识别的无毒蛋白非常相似。对于秆锈病和白粉病抗性基因来说，Avr基因的鉴定可能会更快一些，因为已经有几个NLR免疫受体所识别的无毒基因被鉴定（表1）。这些工作有助于确定非NLR小种特异型抗性基因，特别是编码激酶结构域的蛋白是否需要NLR参与，或者它们是否是非多态的、或多余的NLR蛋白的守护者，类似于番茄中的Pto-Prf互作，其中Pto激酶是病原体效应因子的目标（图1）。
通过回交或建立转基因品系，在确定的、纯感病的遗传背景中研究单一非NLR基因的抗性表型也非常重要。此外，遗传背景与基因功能的相关性也必须被详细的研究：例如，Lr14a编码的蛋白在不同遗传背景下赋予植物独特的抗性表型，受几个修饰基因的调控。对修饰基因的进一步表征将使人们深入了解基因功能的分子机制。最后，必须探索所有新类型的抗性蛋白在农业中的应用，以及通过突变进行改进的可能。未来对谷物中大量的遗传描述的抗性基因及其相应的Avr基因进行分离，将建立R-Avr蛋白的整个互作组，并为制定有效的、持久的谷物病害防治策略提供基础。
(A) WAK介导的感病性/抗病性：病原体分泌的SnToxA与Snn1WAK蛋白通过直接的互作被识别，再经过信号转导诱发细胞死亡，产生Septoria nodorum斑点病。而Stb6 WAK蛋白通过检测相应的非原质体的无毒蛋白AvrStb6，诱发强烈的抗性反应，从而完全阻断Septoria tritici斑点病的扩展。
(B) TKP介导的抗病性（Rpg1，Yr15）：这些膜蛋白的信号级联反应目前尚不清楚。假激酶结构域可能作为锈病效应因子的诱饵。当识别效应因子时，假激酶蛋白可能作为一个 '分子开关 '来激活激酶结构域。另外，由于TKP蛋白和PRRs（图1）的激酶结构域在序列上具有高度相似性，TKP可能是非多态的、冗余的NLRs的卫士。假激酶结构域将作为辅助因子（诱饵）稳定与NLR的相互作用，从而导致对后者的抑制。效应因子与假激酶结合触发TKP蛋白的结构变化，进而激活NLR。
(C) Lr14a介导的抗病性：Lr14a基因编码一种膜结合蛋白，具有多个锚蛋白结构域，与非选择性阳离子通道结构相似。目前仍不清楚Ca2 是否在Lr14a介导的抗病反应中起作用，以及相应的效应因子是如何被识别的。
(D) YrU1介导的抗病性：在提出的模型中，效应因子与WRKY结构域结合，导致YrU1蛋白通过ANK和CC结构域发生构象变化和寡聚化。
(E) BED-NLR介导的抗病性：BED结构域在典型的NLR蛋白中替代了CC结构域，可能作为病原体效应因子的诱饵，BED结果域识别效应因子，构想改变并寡聚化被激活。
(F) NLR介导的抗病性：典型的NLR可能通过直接、间接（守卫/诱饵）的活化，综合诱饵识别模型。这里展示了Sr35介导的抗性，Sr35 NLR蛋白通过LRR结构域直接识别AvrSr35蛋白，激活疾病抗性。
(G) Pm4b介导的抗病性：在没有AvrPm4的情况下，Pm4b_V1和Pm4b_V2形成一个内质网（ER）相关的异构体，通过C2结构域相互作用。当AvrPm4被激酶结构域识别时，异质体可能发生构象变化，导致激酶活性的激活和抗病性。
对23个主要涉及谷物抗病性的蛋白激酶催化结构域进行了多氨基酸序列比对，以推断TKP和Pm4b蛋白的激酶结构。该比对使用Clustal Omega程序进行，并在JaviView 2.8中以ClustalX彩色模式显示。保守结构域I到XI用方框突出显示。红色箭头标志着不变的残基（G52, K72, E91, D166,N171, D184, G186, E208, R280），这些残基用大写字母编号，与它们在cAMP依赖性蛋白激酶催化单元（cAPK）的形式中的位置对应。同样地，黑色箭头表示大部分不变的残基（G50, V57,F185, D220, G225）。基于cAPK在子域VI的R165位存在一个L残基，TKP和Pm4 Kin域被归类为非RD 激酶。此外，子域VI（D166->N171）和VIII（GT/SXXY/FXAPE）中的保守残基表明，TKP和Pm4编码的激酶蛋白具有丝氨酸/苏氨酸蛋白特异性。有趣的是，TKPs（除Yr15外）和Pm4的激酶结构域在结构域IV和V之间有一个保守的序列（在排列的上半部分用红框突出显示），在其余含激酶的PRRs中没有。标签：红色和黑色箭头，分别是蛋白激酶催化结构域中关键的不变和几乎不变的残基。浅蓝色钻石指向RD或非RD激酶决定位点。物种缩写。At,Arabidopsis thaliana; Hv, Hordeum vulgare; Os, Oryza sativa; Sp, Solanumlycopersicum; Ta, Triticum aestivum; Tt, Triticum turgidum; Tm, Triticummonococcum; Zm, Zea mays. UniProt登录号如下。BAK1（Q94F62），BIK1（O48814），BRI1（O22476），BSK1（Q944A7），CERK1（A8R7E6），EFR（C0LGT6），FLS2（Q9FL28），FLS3（A0A3Q7FWR4），PBS1（Q9FE20），Pi-d2（Q0DC23），Pm24（A0A6B9QRM0）。Pto（P93215），PTI1（B4FZN9），RBK1（I2FLM1），Rpg1（Q8L3P8），Snn1（W5AB81），Sr60（A0A5C1K2R9），Stb6（A0A1D5VHV3），Tsn1（D7PDA0），Yr15（A0A2Z5GZM3），Xa26（Q2EZ14）。Pm4b已在GenBank登录号MT783929和MT783930下提交。请注意，每个蛋白质名称前都有物种缩写。最后，在TKP蛋白中，K1和K2分别代表第一和第二激酶结构域。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526621000534