免疫组化实验操作，新手快速入门必看！
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01/免疫组化原理
免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
作用：通过颜色来显示蛋白质的有无、定位（胞外、胞膜、胞浆、胞核）、含量变化
样本种类：
按来源：①组织；②培养细胞
按制作方式：①石蜡片②冰冻片③细胞片
免疫组化/荧光图
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02/免疫组化流程图
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03/免疫组化实验步骤
固定的目的是为了使蛋白质凝固，减少或终止内源性/外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保存组织或细胞内的抗原性。现在常用的固定剂有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。有些固定剂对特殊组织有更好的效果，如苦味PLP固定液对于含糖组织保存更好，Helly固定液对于胰岛和垂体效果较好等。
脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水，对于一些易脆的组织应减少高浓度酒精里的停留时间，透明的时间也应该控制缩短。对组织浸蜡时，一般选用56℃-58℃熔点石蜡，浸蜡温度最好不超过60℃，防止抗原的损失。包埋时应果断迅速，切片时注意检查刀片是否出现缺口，防止；蜡带出现裂痕。
使组织恢复到固定后的正常状态暴露抗原，方便与一抗结合。若脱蜡与水化不完全易出现局灶性反应和浸洗不完全，产生非特异性背景着色。
由于组织在甲醛或多聚甲醛在固定中，发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率，常用方法通常使用高压加热修复，使用高压加热修复对修复温度和时间的把握十分重要，温度越高修复时间越短，温度与修复时间呈负相关。修复结束后注意室温冷却，让蛋白自然复性。另外，大家尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆影响。
传统的免疫组化法容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须对其进行灭活和封闭。灭活内源性过氧化酶一般用3%过氧化氢灭活10min左右，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织。
血清封闭的目的是为了一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性，一般会采用BSA、羊血清等封闭这些位点，封闭血清一般是和二抗同一来源的，室温封闭10-30min。
不同的一抗浓度，孵育时间和温度等对染色结果往往有较大的影响。在4℃下，反应缓慢，背景较浅；而37℃反应较快，时间较短；室温介于两者之间，二抗一般室温孵育30min。
检测背景的深浅和特异性染色的深浅基本上都以DAB孵育条件决定。DAB的显色时间并不是固定的，主要方法是使用显微镜控制显色时间，到出现特异性染色较强且出现背景着色较浅时就可以冲洗。如果DAB显色时间过长（超过十分钟）才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长，也可以加入金属离子来增强显色（如硫酸铜、氯化钴、硫酸镍铵等）；如果DAB显色时间过短颜色就很深，这可能是一抗过高，需要下调抗体浓度，如果短时间内过深。
免疫组化染色后为了衬托出组织形态结构有必要进行复染，常用试剂为Mayer’s苏木染色，一般为2 min左右，DAB在核蛋白着色的时间可以适当缩短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返蓝。
在封片阶段我们通常是用中性树胶来进行，封片过程中注意斜靠盖玻片防止气泡的产生从而对结果进行营影响，建议最好在通风橱操作，这样有利于气泡排除干净，不影响后续的镜检。
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04/免疫组化常见问题分析
1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；
2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；
3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；
4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。
1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；
2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；
2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
5）DAB孵育时间过长或浓度过高；
6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；
2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复；
3）组织切片本身这种抗原含量低；
4）血清封闭时间过长；
5）DAB孵育时间过短；
6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；
7）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
1）考虑一抗浓度高；
2）然后调整DAB孵育时间；
3）也要考虑血清封闭时间是否过短；
4）适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间；
（本文转自钰博生物）